高雪婧，羅思奕，湯凱潔，羅秋水

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,江西 南昌,330045)

山楂為薔薇科植物山楂(CrataeguspinnatifutaBge.)的干燥成熟果實(shí)，具有健脾開胃、消食化滯等功效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，山楂具有降血脂作用，能明顯降低總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯 (triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平，升高高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C) 水平[2-3]，可以用來預(yù)防和治療高血脂，且無副作用。山楂屬于藥食同源的優(yōu)質(zhì)原料，從中已分離鑒別出總黃酮、三萜酸和植物甾醇[4]等多種降血脂活性成分，但目前國(guó)內(nèi)外鮮見有研究其糖蛋白降血脂活性成分。糖蛋白(glycoprotein)是一類糖類與多肽或蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵連接而形成的結(jié)合蛋白，作為一種糖和蛋白質(zhì)的復(fù)合物，具有多方面的生物活性，如抗氧化[5]、免疫調(diào)節(jié)作用[6-8]、體外抗腫瘤活性[9]、降血脂[10]等。

隨著人們生活水平的提高，膳食結(jié)構(gòu)的改變對(duì)人體健康產(chǎn)生了重要影響，高脂血癥發(fā)生率逐年攀升。通過膳食干預(yù)有效調(diào)節(jié)血脂代謝，提高機(jī)體抗氧化酶活性，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，已成為大眾關(guān)切的問題[11-13]。本文通過制備山楂粗糖蛋白來探究其對(duì)高脂小鼠的降脂及抗氧化能力，以期為開發(fā)新型糖蛋白產(chǎn)品的降脂、抗氧化功能提供一定的理論依據(jù)，同時(shí)也為山楂的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂市售；清潔級(jí)KM雌性小鼠(質(zhì)量：18～22 g)50只，實(shí)驗(yàn)鼠維持飼料，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002；食用豬油，四川溢州油脂有限公司；膽固醇、脫氧膽酸鈉、丙硫氧嘧啶、吐溫-80、丙二醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、乙醚等試劑均為分析純；TC、TG、HDL-C、過氧化氫酶(catalase，CAT)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)，總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)試劑盒，南京建成生物工程研究所；BCA蛋白定量試劑盒，北京普利萊基因技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-20000CR高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；FD-1 真空冷凍離心機(jī)，北京博醫(yī)康技術(shù)公司；Multiscan MK3酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo electron公司；旋渦混合器，美國(guó)Thermo Scientific公司；BS-100A 自動(dòng)部分收集器；DW-86 W420 J醫(yī)用低溫保存箱，青島海爾特種電器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 山楂粗糖蛋白樣品的制備

新鮮山楂洗凈去核，50 ℃烘干后粉碎備用。稱取一定質(zhì)量的山楂粉末，設(shè)置超聲功率150 W、料液比1∶20(g∶mL)、超聲時(shí)間30 min，重復(fù)3次提取樣品，雙層紗布過濾，5 000 r/min離心15min除去沉淀，在所得的上清液中加入體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇，5 000 r/min離心15 min,重復(fù)3次沉淀樣品，所得沉淀溶于蒸餾水中，Sevage法去除游離蛋白，離心所得沉淀經(jīng)真空冷凍干燥得到樣品粉末。取樣品粉末溶解配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，上DEAE-52 纖維素樹脂柱，依次用0.10、0.30、0.50、0.70、0.90 mol/L的NaHCO3進(jìn)行梯度洗脫，收集蛋白質(zhì)和多糖重疊峰的洗脫液進(jìn)行透析，真空冷凍干燥得到微紅色山楂粗糖蛋白粉末，然后進(jìn)行Sephadex G-75純化，再次收集洗脫液真空冷凍干燥得到白色山楂粗糖蛋白粉末，通過考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定波長(zhǎng)在595 nm處和苯酚-硫酸法檢測(cè)波長(zhǎng)在490 nm處吸光度的方法[14]，測(cè)得山楂粗糖蛋白純度為69.15%。

1.3.2 高脂乳劑的配制

參考白冰瑤等[12]、胡文兵等[15]方法制備高脂乳劑。油相：20 g豬油、10 g膽固醇、1 g丙硫氧嘧啶、20 mL吐溫-80；水相：20 mL丙二醇、2 g脫氧膽酸鈉、30 mL蒸餾水。油相加熱至融化，將混合充分的水相倒入油相中不斷攪拌，充分溶解后冷卻至室溫，加蒸餾水定容到100 mL，4 ℃保存，使用時(shí)水浴回溫至37 ℃。

1.3.3 動(dòng)物分組及建模

50只雌性KM小鼠適應(yīng)性飼喂3 d后，隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組、高脂模型組、山楂粗糖蛋白低、中、高劑量組。飼養(yǎng)期間小鼠自由飲水、攝食，每日投放等量飼料，飼養(yǎng)溫度為室溫條件。每天定時(shí)灌胃，每周定時(shí)稱重,每日處理情況見表1。

表1 小鼠分組及每日處理Table 1 Grouping and daily treatment of mice

1.3.4 血清、肝臟采集與處理

灌胃8周后，對(duì)小鼠禁食12 h，記錄體重，乙醚麻醉后解剖小鼠，心臟采血，4 ℃條件下3000 r/min離心10 min，分離上清液。肝臟稱取質(zhì)量，用生理鹽水清洗拭干置于離心管中，-80 ℃下冷藏[16-17]。

1.3.5 小鼠血脂及抗氧化能力測(cè)定

根據(jù)試劑盒操作測(cè)定血清中TC、TG、HDL-C含量及肝組織勻漿中CAT、T-SOD、T-AOC活性和MDA含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，Origin Pro 8.5.1軟件制圖，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂粗糖蛋白對(duì)小鼠血脂的影響

高脂乳劑灌胃導(dǎo)致小鼠血脂異常，而山楂粗糖蛋白可改善高脂小鼠血清的TC、TG、HDL-C水平[18-19]。

表2 山楂粗糖蛋白對(duì)小鼠血清TC、TG和 HDL-C含量的影響 單位：mmol/L

由表2可知，與空白對(duì)照組相比，高脂模型組TC、TG水平極顯著升高(P<0.01)，高脂模型組HDL-C水平極顯著降低(P<0.01)，表示高脂小鼠已成功建模。同時(shí)，與高脂模型組相比，山楂粗糖蛋白劑量組的TC、TG均顯著降低,HDL-C水平顯著升高(P<0.01)。由此可知，山楂粗糖蛋白能有效改善高脂小鼠血清TC、TG和HDL-C的水平。

2.2 山楂粗糖蛋白對(duì)小鼠肝臟抗氧化能力的影響

高脂膳食會(huì)增加體內(nèi)自由基生成量，導(dǎo)致小鼠發(fā)生氧化應(yīng)激，激發(fā)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的形成，使得肝臟抗氧化酶活性降低[21-22]。

2.2.1 山楂粗糖蛋白對(duì)小鼠肝臟CAT的影響

由圖1可知，高脂模型組CAT活性遠(yuǎn)低于空白對(duì)照組(P<0.01)，表明高脂乳劑抑制了小鼠體內(nèi)的CAT活性；與高脂模型組相比，山楂粗糖蛋白低劑量組對(duì)CAT活性有一定提高，而中、高劑量組對(duì)CAT活性極顯著提高 (P<0.01)，由此表明，山楂粗糖蛋白能有效增強(qiáng)高脂小鼠體內(nèi)CAT活性。

圖1 山楂粗糖蛋白對(duì)小鼠肝臟CAT活性的影響Fig.1 Effect of the crude glycoprotein from hawthorn on CAT activities in mice liver

2.2.2 山楂粗糖蛋白對(duì)小鼠肝臟MDA的影響

由圖2可知，高脂模型組MDA活性水平極顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)，說明在高脂乳劑的誘導(dǎo)下小鼠處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，致使體內(nèi)MDA升高[23]；與模型組相比，山楂粗糖蛋白低、中、高劑量組的MDA含量顯著降低(P<0.01)，說明山楂粗糖蛋白具有良好的抗氧化性，能起到減弱組織的氧化損傷的程度，清除氧化應(yīng)激代謝產(chǎn)物的功能。

圖2 山楂粗糖蛋白對(duì)小鼠肝臟MDA水平的影響Fig.2 Effect of the crude glycoprotein from hawthorn on MDA contents in mice liver

2.2.3 山楂粗糖蛋白對(duì)小鼠肝臟T-SOD的影響

由圖3可知，與空白組相比，高脂模型組T-SOD活性明顯降低(P<0.05)；與高脂模型組相比，山楂糖蛋白低劑量組T-SOD活性明顯提高(P<0.05)，而中、高劑量組極顯著提高(P<0.01)，表明山楂粗糖蛋白能有效提高小鼠體內(nèi)的T-SOD活性，具有良好的抗氧化能力。

圖3 山楂粗糖蛋白對(duì)小鼠肝臟T-SOD活性的影響Fig.3 Effect of the crude glycoprotein from hawthorn on T-SOD activities in mice liver

2.2.4 山楂粗糖蛋白對(duì)小鼠肝臟T-AOC的影響

由圖4可知，與空白對(duì)照組相比，高脂模型組T-AOC 極顯著降低(P<0.01)，表示高脂建模組有效降低了機(jī)體的總抗氧化能力；與模型組相比，山楂粗糖蛋白中、高劑量組T-AOC極顯著提高 (P<0.01)，而低劑量組T-AOC有一定提高，說明山楂粗糖蛋白能有效提升高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肝臟中總抗氧化能力。

圖4 山楂粗糖蛋白對(duì)小鼠肝臟T-AOC活性的影響Fig.4 Effect of the crude glycoprotein from hawthorn on T-AOC activities in mice liver

3 結(jié)論與討論

無論人體還是動(dòng)物長(zhǎng)期飲食高脂食物會(huì)引起代謝紊亂，導(dǎo)致血清中TC、TG等升高和HDL-C降低，從而引起肝內(nèi)脂肪堆積，形成高血脂、脂肪肝等。相關(guān)研究表明，高脂血癥與高血糖、高血壓等有重要關(guān)系，且與冠心病的發(fā)病關(guān)系很密切。同時(shí)，高脂膳食會(huì)使體內(nèi)代謝增高產(chǎn)生大量自由基，引起代謝產(chǎn)物MDA含量增大，MDA對(duì)細(xì)胞具有嚴(yán)重的毒副作用；然而MDA又極易修飾低密度脂蛋白，促使泡沫細(xì)胞形成，由此促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的形成。CAT、T-SOD是體內(nèi)2種重要的抗氧化酶，正常情況可及時(shí)清除體內(nèi)氧化代謝產(chǎn)物，保護(hù)細(xì)胞免受傷害。但當(dāng)人體內(nèi)氧化應(yīng)激水平過高時(shí)，其活力大幅度下降，引起氧化與抗氧化之間的平衡失調(diào)，從而引發(fā)一系列代謝性疾病[24-25]。植物來源的抗氧化劑安全且廉價(jià)；山楂作為深受大眾青睞的原料，具有良好的降脂保健功能和酸甜可口的獨(dú)特風(fēng)味，已被加工為山楂片、復(fù)合飲料等多種形式的食品[26-29]。目前有關(guān)山楂的研究多集中于新產(chǎn)品的配方研制及工藝優(yōu)化，少有研究其有效成分對(duì)于體內(nèi)的降脂和抗氧化作用，因此，對(duì)于其糖蛋白作用機(jī)理的研究仍需進(jìn)一步闡明。

本研究通過連續(xù)喂養(yǎng)4周高脂乳劑的方法建立高脂模型小鼠，以空白組作對(duì)照，通過連續(xù)喂養(yǎng)4周山楂粗糖蛋白低、中、高劑量組來探討其對(duì)高脂模型小鼠肝臟降脂及抗氧化作用。結(jié)果表明：山楂粗糖蛋白中、高劑量組TC、TG水平顯著升高(P<0.01)和HDL-C水平顯著下降(P<0.01)，山楂粗糖蛋白低劑量組TC水平明顯升高(P<0.05)、TG水平顯著升高(P<0.01)和HDL-C水平顯著下降(P<0.01)，說明山楂粗糖蛋白能有效改善高脂小鼠血清TC、TG和HDL-C的水平;山楂粗糖蛋白低劑量組對(duì)CAT、T-SOD活性和T-AOC有一定提高，而中、高劑量組顯著提高CAT、T-SOD活性和T-AOC (P<0.01)；山楂粗糖蛋白低、中、高劑量組的MDA含量顯著提高(P<0.01)；由此說明山楂粗糖蛋白對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)小鼠具有較好的抗氧化性能。綜上所述，山楂粗糖蛋白能有效調(diào)節(jié)高脂小鼠血脂代謝，提高機(jī)體抗氧化能力，并在研究范圍內(nèi)具有顯著量效關(guān)系，為山楂的綜合利用開發(fā)提供參考價(jià)值。