孫燁，李英浩，WULANDARI，呂麗爽，張秋婷

(南京師范大學(xué) 食品與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京，210000)

近年來，隨著消費(fèi)者對(duì)健康食品的需求與日俱增，可食用聚合物在食品工業(yè)中用作乳化劑、增稠劑等相關(guān)研究也越來越多，尤其是蛋白質(zhì)[1]。玉米醇溶蛋白(zein)作為玉米中重要的貯藏蛋白，由于其結(jié)構(gòu)的兩親性特征[2-3]，能夠在溶劑極性變化下自組裝形成近圓形納米顆粒(zein nanoparticle，ZNP)[4]。但是，ZNP表面存在大量疏水性氨基酸，導(dǎo)致其在水溶液中容易絮凝沉淀，因此很多研究利用多糖如阿拉伯膠[5]、黃原膠[6]和果膠[7]等作為疏水性蛋白的保護(hù)層，通過靜電、疏水等作用力相結(jié)合，提高親水性從而形成穩(wěn)定的乳液[4]。亞麻籽膠(flaxseed gum，F(xiàn)SG)是從亞麻籽殼中提取的一種親水膠體，也是一種可溶性的膳食纖維，具有較強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[8]。不僅如此，F(xiàn)SG還具有多種功能性質(zhì)，增稠性可以提高溶液體系穩(wěn)定性，由于分子結(jié)構(gòu)上結(jié)合了少量蛋白質(zhì)，F(xiàn)SG也具有表面活性和乳化性，可穩(wěn)定水包油型(oil in water,O/W)乳液[9-10]。將亞麻籽膠與醇溶蛋白結(jié)合，發(fā)揮親水膠體優(yōu)勢(shì)，可顯著提升乳液體系穩(wěn)定性。

Pickering乳液的穩(wěn)定性很大程度上決定于液滴表面固體顆粒的大小、分布、極性和微觀形貌等因素，可以通過各種物理、化學(xué)和酶法等手段對(duì)其進(jìn)行改性優(yōu)化。已有研究表明，超聲波可以通過改變?nèi)榍宓鞍?、牛血清蛋白和花生蛋白等?dòng)植物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的粒徑及功能性質(zhì)[11-13]。然而，上述結(jié)論是建立在水溶性蛋白質(zhì)的超聲波處理上，鮮少有研究關(guān)于超聲波對(duì)醇溶蛋白的作用，尤其是醇溶液中的玉米蛋白和小麥蛋白等。因此，擬研究超聲波預(yù)處理對(duì)醇溶液中zein結(jié)構(gòu)的影響，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究不同超聲波條件處理對(duì)zein與FSG復(fù)合物的穩(wěn)定性的影響。

本文利用不同條件的超聲波處理zein醇溶液，通過反溶劑沉淀法制備ZNP；然后，將不同處理所得的ZNP與FSG通過靜電相互作用等形成蛋白-多糖復(fù)合顆粒，進(jìn)一步觀察超聲波預(yù)處理對(duì)ZNP-FSG復(fù)合顆粒性質(zhì)的影響；最后利用ZNP-FSG復(fù)合顆粒均質(zhì)制備成Pickering乳液，利用顯微鏡觀察、液滴粒徑和高溫實(shí)驗(yàn)探究超聲波預(yù)處理對(duì)乳液特性的影響，為將超聲波應(yīng)用于Pickering乳液制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白，上海麥克林生化科技股份有限公司；亞麻籽膠，上海源葉生物科技有限公司；金龍魚食用植物調(diào)和油，益海嘉里食品有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；NaOH、HCl等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JY-IIN型超聲細(xì)胞破碎儀，浙江寧波新芝儀器有限公司；Nano-ZS納米粒度儀，英國(guó)Malvern公司；F97Pro型熒光光譜儀，上海棱光技術(shù)有限公司；CHIRASCAN型數(shù)字式圓二色光譜儀，英國(guó)Applied Photophysics公司；FJ200-SH型高速分散機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；Alpha 1-2 D Pius冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Marin Christ公司；JSM-5610LV型高分辨掃描電子顯微鏡-X射線能譜儀，日本JEOL公司；IX73型倒置顯微鏡，日本Olympus公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 超聲波預(yù)處理

稱取1.0 g玉米醇溶蛋白溶于40 mL體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液中，磁力攪拌器1000 r/min攪拌1 h，使其充分溶解，用離心管分裝成4份，每份樣品10 mL，空白組為N-zein。取樣品進(jìn)行超聲波處理,超聲儀最大功率680 W，參數(shù)設(shè)置條件分別為U1∶10%-20 min、U2∶10%-40 min、U3∶20%-20 min、U4∶30%-20 min、U5∶40%-20 min，超聲探頭直徑6 mm，換算為功率強(qiáng)度分別約為U1∶230 W/cm2-20 min、U2∶230 W/cm2-40 min、U3∶460 W/cm2-20 min、U4∶690 W/cm2-20 min、U5∶920 W/cm2-20 min。超聲波處理過程中，探頭充分浸沒于樣品溶液中，并保持樣品管置于冰浴中以控制樣品溫度低于5 ℃。超聲波處理時(shí)采用工作5 s，暫停5 s的工作模式，處理完畢，放入4 ℃冰箱24 h過夜。

1.3.2 玉米醇溶蛋白納米顆粒的制備

采用反溶劑沉淀法，按照J(rèn)IANG等[14]的方法并稍作修改。將10 mL超聲波處理的玉米醇溶蛋白乙醇溶液倒入堿式滴定管，將裝有30 mL蒸餾水的燒杯置于超聲波水浴中，開啟超聲波防止絮凝物出現(xiàn)，使滴定管中的樣品逐滴滴入，直至結(jié)束。最后，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去多余的乙醇，水浴溫度為45 ℃，旋至蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為20 mg/mL，并調(diào)節(jié)溶液pH至4.0，放入4 ℃冰箱保存，備用。

1.3.3 內(nèi)源熒光光譜測(cè)定

采用王中江等[15]的方法。用pH 4.0的去離子水將樣品稀釋至質(zhì)量濃度1 mg/mL，測(cè)定條件為波長(zhǎng)295 nm處激發(fā)，掃描范圍為300～400 nm、狹縫寬度為5 nm和掃描速度為1 200 nm/min，記錄發(fā)射光譜。

1.3.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

參照ERICKSON等[16]的方法。采用遠(yuǎn)紫外區(qū)圓二色譜探究超聲波處理對(duì)zein二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。測(cè)定在室溫(25 ℃)、持續(xù)通氮?dú)獾臈l件下進(jìn)行，利用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液將樣品稀釋至質(zhì)量濃度0.2 mg/mL，掃描速度為100 nm/min，掃描范圍為190～260 nm，帶寬1 nm，樣品池光程為1 mm。使用Dicroprot軟件對(duì)所收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3.5 粒徑和zeta電位測(cè)定

粒徑測(cè)定采用JIANG等[7]的方法，采用納米粒度儀測(cè)定ZNP和ZNP-FSG復(fù)合顆粒的粒徑，測(cè)量前將所有樣品用pH 4.0的去離子水稀釋至質(zhì)量濃度1 mg/mL。在室溫(25 ℃)下測(cè)定粒徑、分散性指數(shù)以及電位，。

1.3.6 ZNP-FSG復(fù)合顆粒的制備

配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL亞麻籽膠水溶液，水浴95 ℃、磁力攪拌1 h至完全溶解，調(diào)節(jié)pH至4.0，放置冰箱24 h過夜。將10 mL 質(zhì)量濃度10 mg/mL的ZNP溶液與10 mL質(zhì)量濃度10 mg/mL的FSG溶液等體積混合，使ZNP與FSG質(zhì)量比為1∶1，15 000 r/min下高速均質(zhì)2 min，混合，放入冰箱靜置24 h過夜，備用。

1.3.7 表面疏水性測(cè)定

根據(jù)KATO等[17]采用ANS作為熒光探針對(duì)樣品的表面疏水性進(jìn)行測(cè)定。在5 mL ZNP中加入50 μL 8.0 mmol/L的ANS溶液(pH 4.0)，用pH 4.0的去離子水將樣品稀釋成一定梯度(0.01～1 mg/mL)，用熒光分光光度計(jì)在390 nm激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度，掃描范圍為400～600 nm，狹縫寬度為5 nm。用線性回歸分析法計(jì)算熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的初始斜率，作為蛋白質(zhì)表面疏水性指數(shù)。

1.3.8 形貌特征觀察

將樣品溶液凍干成粉末，稱取少量樣品，凍干后的樣品黏附到導(dǎo)電膠，然后粘到圓柱形的樣品柱上。采用高分辨掃描電子顯微鏡對(duì)ZNP及ZNP-FSG復(fù)合顆粒微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

1.3.9 Pickering乳液的制備

將ZNP-FSG復(fù)合膠體顆粒溶液與食用油按體積比1∶1混合，油水體系采用剪切分散機(jī)于18 000 r/min下剪切3 min，將形成的Pickering乳液放置于4 ℃冰箱儲(chǔ)藏，備用。

1.3.10 液滴尺寸及形態(tài)觀測(cè)

根據(jù)ZHU等[18]的方法，采用粒度分布儀測(cè)定乳液的粒徑和電位。參數(shù)設(shè)置為：分散劑,水；顆粒折射率1.460；顆粒吸收率0.001；分散劑折射率1.330。采用面積平均直徑d32來表征顆粒和乳液液滴粒度的大小。

顯微鏡觀察：吸取中部位置乳液50 μL,緩慢滴入載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片，防止液滴破裂，分別在4和40倍物鏡下用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察，連接顯微成像系統(tǒng)DP80相機(jī)，使用圖像采集軟件CellSens standard觀察液滴形態(tài)。

1.3.11 耐高溫穩(wěn)定性

將新鮮制備的乳液倒入統(tǒng)一規(guī)格的具塞玻璃管，置于80 ℃水浴30 min后，立即置于冰浴降溫至室溫并取出，觀察乳液前后穩(wěn)定性的差異，用顯微鏡放大4倍觀察乳液液滴形態(tài)。

1.3.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 24.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Origin 2017軟件進(jìn)行圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波預(yù)處理對(duì)玉米醇溶蛋白結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 內(nèi)源熒光光譜分析

蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光的特點(diǎn)是由蛋白質(zhì)中芳香氨基酸(色氨酸和酪氨酸等)所在位置的差異決定的，有助于評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化及特點(diǎn)。不同超聲波預(yù)處理的玉米醇溶蛋白熒光光譜圖如圖1所示，醇溶液中玉米蛋白經(jīng)295 nm激發(fā)后在385 nm附近出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，含有高比例的乙醇溶液可能使色氨酸基團(tuán)的最大吸收波長(zhǎng)(λmax)從348 nm紅移至385 nm。天然的玉米醇溶蛋白表面含有較多疏水性氨基酸，可能存在色氨酸基團(tuán)，導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度較高[19]。與未處理的N-zein組比較，超聲波處理蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度均呈現(xiàn)一定程度地降低。研究表明，由于芳香族氨基酸特性，色氨酸殘基通常被完全或部分地埋在蛋白質(zhì)的疏水核心內(nèi)，超聲波引發(fā)的高剪切作用，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，使緊緊相連的α-zein分子變得疏松，更多色氨酸開始暴露，接觸極性環(huán)境導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低[20]。隨著超聲強(qiáng)度從U1增加至U5,處理時(shí)間延長(zhǎng)至U2，熒光強(qiáng)度不斷降低,說明蛋白質(zhì)螺旋結(jié)構(gòu)更加趨于開放。

圖1 不同超聲條件下玉米醇溶蛋白熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectrum of zein under different ultrasonic conditions

由不同超聲波預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)玉米醇溶蛋白的最大發(fā)射峰位置的影響分析發(fā)現(xiàn),U1、U3和U4處理組相較于N-zein藍(lán)移至382 nm，適宜的超聲強(qiáng)度和處理時(shí)間促使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的色氨酸基團(tuán)向內(nèi)部疏水區(qū)域轉(zhuǎn)移。相反，U2和U5處理組的最大發(fā)射波長(zhǎng)紅移至390 nm處，且熒光強(qiáng)度相近。對(duì)比超聲功率與超聲時(shí)間的影響發(fā)現(xiàn),超聲時(shí)間的延長(zhǎng)(U2∶230 W/cm2-40 min)較功率增加(U3和U4)影響程度更大，可顯著降低熒光強(qiáng)度，與超聲條件為 U5∶920 W/cm2-20 min時(shí)相當(dāng)，最大熒光強(qiáng)度達(dá)到最低水平(66.5)。發(fā)射峰紅移的原因可能是由色氨酸周圍的空間環(huán)境結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，長(zhǎng)時(shí)間和高強(qiáng)度的超聲波使芳香族氨基酸側(cè)鏈暴露在蛋白質(zhì)的表面，其周圍的溶液極性升高，對(duì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了不利的影響。MATSUSHMIA等[21]發(fā)現(xiàn),α-zein在體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇水溶液中呈帶狀，由10個(gè)左右相鄰的螺旋柱體結(jié)構(gòu)反向平行排列構(gòu)成，兩端通過谷氨酰胺與前后2個(gè)螺旋連接。而長(zhǎng)時(shí)間和較高強(qiáng)度的超聲波處理使兩兩相鄰螺旋距離變大，空間結(jié)構(gòu)變得更加開放。

2.1.2 圓二色光譜分析

圓二色光譜是用于評(píng)估蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的常用技術(shù)手段之一，用于探究超聲處理對(duì)乙醇溶液中的玉米醇溶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。圖2顯示了N-zein與超聲處理組在190～260 nm的遠(yuǎn)紫外圓二色光譜。所有zein處理組的圓二光譜在193 nm附近具有正峰，在202 nm處與零線相交，同時(shí)2個(gè)負(fù)峰在209和224 nm處出現(xiàn)，這表明無論超聲與否，zein都是典型的富含α-螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，此結(jié)果與之前的研究一致[22]。根據(jù)α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的光譜數(shù)據(jù)，計(jì)算N-zein和超聲處理組的圓二色光譜的不同結(jié)構(gòu)的占比，并進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。表1展示了不同超聲條件下蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量，經(jīng)數(shù)據(jù)分析，N-zein的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成分別為45.5% α-螺旋、12% β-折疊、9.5%β-轉(zhuǎn)角和35.4%的無規(guī)則卷曲，這一結(jié)果與先前SELLING等[23]和ERICKSON等[16]研究結(jié)果一致，在體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇水溶液中，zein的α-螺旋含量在33.6%～60%，表明zein在醇水溶液中具有球狀結(jié)構(gòu)。

圖2 不同超聲處理對(duì)玉米醇溶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響Fig.2 Effect of different ultrasonic treatment on the secondary structure content of zein

表1 不同超聲條件下玉米醇溶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量 單位：%

如圖2和表1所示，當(dāng)超聲強(qiáng)度較低時(shí)(U1～U3)，圖中曲線與對(duì)照組相比變化并不明顯，結(jié)構(gòu)含量變化并不顯著，表明低強(qiáng)度的超聲波對(duì)zein的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量影響較小。值得注意的是，當(dāng)超聲強(qiáng)度達(dá)到U4時(shí)，208和224 nm處的2個(gè)負(fù)峰強(qiáng)度上升，表明α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增加，由45.0%分別增加至58.0%和60.5%；同時(shí)，216 nm處的負(fù)峰強(qiáng)度也上升，這些現(xiàn)象表明，高強(qiáng)度超聲波導(dǎo)致β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量顯著降低，由數(shù)據(jù)分析可得，β-折疊從12.0%降低到3.5%，β-轉(zhuǎn)角含量也降低至3.6%，β-折疊含量的減少會(huì)降低蛋白質(zhì)的柔韌性和擴(kuò)展性，使zein分子結(jié)構(gòu)更加具有剛性[24-25]；然而超聲波預(yù)處理對(duì)于zein結(jié)構(gòu)中的無規(guī)則結(jié)構(gòu)含量，作用不大。這些現(xiàn)象與REN等[22]的結(jié)果有所不同，其超聲波處理的zein三種結(jié)構(gòu)含量均無明顯變化，可能是因?yàn)槠涑曁幚頃r(shí)的溶劑為水溶液，醇溶蛋白無法溶于水，導(dǎo)致超聲波無法影響其二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

玉米醇溶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化將會(huì)影響其自組裝的過程，由于自組裝主要是由zein受到溶劑極性的變化影響，其中α-螺旋結(jié)構(gòu)自發(fā)變成β-折疊進(jìn)行排列，后續(xù)多個(gè)長(zhǎng)帶狀的zein進(jìn)行卷曲形成球形納米顆粒[26]。因此，猜測(cè)當(dāng)超聲波引起α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增加、β-折疊含量減少時(shí)，其形成納米顆粒的過程將會(huì)變慢，進(jìn)而導(dǎo)致ZNP的粒徑受到影響。

2.1.3 粒徑及zeta電位

不同超聲波預(yù)處理對(duì)反溶劑法制備的ZNP溶液(pH 4.0)粒徑分布影響情況如圖3所示。可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同超聲波處理的ZNP粒徑分布均向左偏移，而且粒徑分布的寬度明顯變窄，這說明超聲波預(yù)處理使ZNP顆粒大小更為集中。其中經(jīng)U1、U3超聲波處理的ZNP平均粒徑降低，但它的曲線寬度卻沒有變窄，分布甚至更加廣泛。

不同超聲條件下ZNP的平均粒徑、峰值粒徑、分散性指數(shù)和電位如表2所示。分散性指數(shù)(polydispersity index，PDI)通常用來反映顆粒的粒徑分布程度。發(fā)現(xiàn)超聲強(qiáng)度為U1時(shí)(230 W/cm2-20 min)，PDI增加，且顯著高于對(duì)照組，低強(qiáng)度超聲波雖然可以降低平均粒徑，但是對(duì)粒徑分布的集中均勻性沒有貢獻(xiàn)，甚至?xí)狗植几臃稚?。隨著超聲時(shí)間增加(U2)，PDI降低，與對(duì)照組相比，顆粒變得更加均勻，說明相同超聲密度，延長(zhǎng)超聲時(shí)間有利于PDI的降低，即有利于顆粒分布更加集中。而當(dāng)超聲強(qiáng)度增加至460 W/cm2-20 min時(shí)，與U1條件具有相似的結(jié)果。當(dāng)超聲強(qiáng)度進(jìn)一步升高到達(dá)U4、U5時(shí)，PDI又繼續(xù)降低，證明了一定強(qiáng)度的超聲波可以促進(jìn)玉米醇溶蛋白納米顆粒大小的均勻性，由此可以說明超聲波處理過程的超聲密度、超聲時(shí)間對(duì)顆粒均勻性有顯著的影響。這與REN等[22]的研究結(jié)果一致。

膠體顆粒溶液的穩(wěn)定性主要取決于顆粒的粒度和表面所帶電荷量，粒徑小和電量高的顆粒溶液體系相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)zeta電位絕對(duì)值大于30 mV，膠體粒子可以借助其排斥靜電力來穩(wěn)定乳液[29-30]。N-ZNP在溶液pH為4.0時(shí)，低于其等電點(diǎn)6.2，表面帶有正電荷，電位值為+26.4 mV。N-ZNP的zeta電位小于30 mV，說明溶液體系是不夠穩(wěn)定的，容易產(chǎn)生沉淀。超聲波預(yù)處理使ZNP的電位絕對(duì)值顯著增加且均高于30 mV，也就是說對(duì)zein進(jìn)行不同超聲波處理均能夠提高ZNP的溶液穩(wěn)定性。相較于其他組，zein經(jīng)U3預(yù)處理所形成的ZNP的zeta電位達(dá)到最高值(+40.9 mV)，此時(shí)的溶液穩(wěn)定性最好。然后進(jìn)一步增加超聲強(qiáng)度(U4、U5)，ZNP的zeta電位逐漸降低，由此可以得出，并非超聲波強(qiáng)度越大ZNP溶液越穩(wěn)定。上述結(jié)果表明，超聲波預(yù)處理可以使ZNP粒徑降低并增加zeta電位絕對(duì)值，但其影響程度與影響規(guī)律受超聲強(qiáng)度和超聲時(shí)間影響。因此，為尋求最有利于ZNP在乳液穩(wěn)定方面表現(xiàn)出更好性能的超聲條件，需要進(jìn)一步分析。

圖3 不同超聲條件下玉米醇溶蛋白粒徑及分布Fig.3 Size distribution of zein under different ultrasonic conditions

表2 不同超聲條件下玉米醇溶蛋白粒徑、分散性指數(shù)及電位Table 2 Size PDI and potential of zein under different ultrasonic conditions

2.2 超聲波預(yù)處理對(duì)ZNP-FSG復(fù)合顆粒微觀形態(tài)和特性的影響

2.2.1 掃描電鏡觀察

ZNP與ZNP-FSG復(fù)合顆粒樣品微觀結(jié)構(gòu)采用掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)分別在放大倍數(shù)為1 000和8 000倍的條件下進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖4所示。ZNP在凍干后整體呈現(xiàn)片狀，結(jié)構(gòu)緊密(圖4-a)。由于ZNP的粒徑較小，且機(jī)器放大倍數(shù)有限，放大至8 000倍時(shí)無法清晰呈現(xiàn)ZNP的球狀結(jié)構(gòu)。隨著FSG的加入，ZNP-FSG復(fù)合顆粒凍干后整體呈細(xì)纖維狀，彼此交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(圖4-b)。當(dāng)放大至8 000倍時(shí)可觀察到ZNP被包裹在FSG的內(nèi)部顯現(xiàn)出圓形顆粒，說明FSG附著在ZNP的表面使粒徑變大，F(xiàn)SG的不平整性導(dǎo)致形成了粗糙的ZNP-FSG復(fù)合顆粒(圖4-c)。

a-N-ZNP(×1 000)；b-N-ZNP-FSG(×1 000)；c-N-ZNP-FSG(×8 000)圖4 玉米醇溶蛋白納米顆粒與玉米醇溶蛋白-亞麻膠 復(fù)合顆粒的SEM圖Fig.4 SEM of ZNP and ZNP-FSG composite particles

2.2.2 表面疏水性分析

當(dāng)不同超聲波預(yù)處理的質(zhì)量濃度10 mg/mL的ZNP溶液加入等量的質(zhì)量濃度10 mg/mL的FSG溶液后，與未添加FSG的N-ZNP相比，U1組的表面疏水性沒有發(fā)生顯著變化，推測(cè)其原因可能是FSG主要通過靜電相互作用與ZNP結(jié)合，同時(shí)這2組ZNP電位值較低導(dǎo)致吸附的FSG數(shù)目較少，ZNP表面的疏水殘基并未受到影響。進(jìn)一步增加超聲強(qiáng)度(U3∶460 W/cm2-20 min)和延長(zhǎng)超聲時(shí)間(U2∶230 W/cm2-40 min)，ZNP的表面疏水性顯著性增強(qiáng)，兩者之間沒有顯著性差異。進(jìn)一步對(duì)比發(fā)現(xiàn)，經(jīng)更高強(qiáng)度的超聲波處理后(U4、U5)，ZNP的表面疏水性略低于處理?xiàng)l件為U2、U3時(shí)的表面疏水性。另外，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，雖然超聲波預(yù)處理可以增加ZNP的表面疏水性，但是添加FSG形成ZNP-FSG復(fù)合顆粒后，其表面疏水性顯著下降，且不同超聲波預(yù)處理對(duì)復(fù)合顆粒的表面疏水性沒有顯著性影響。ZOU等[31]發(fā)現(xiàn)隨著親水性單寧酸的加入，ZNP表面疏水性顯著降低。推測(cè)ZNP表面疏水性顯著降低是由于其表面結(jié)合的FSG增加，但是FSG的加入是否同時(shí)遮蔽了原本由于超聲波預(yù)處理引起的ZNP的結(jié)構(gòu)變化所帶來的影響，還需測(cè)量尺寸和電位來進(jìn)一步確定其組間差異。

圖5 不同超聲條件下玉米醇溶蛋白納米顆粒與玉米醇溶 蛋白-亞麻膠復(fù)合顆粒的表面疏水性Fig.5 Surface hydrophobicity of ZNP and ZNP-FSG composite particles dispersion under different ultrasonic conditions

2.2.3 粒徑及zeta電位

不同超聲條件下ZNP-FSG復(fù)合顆粒的粒徑及分布如圖6所示，由于前處理過程中FSG溶液pH調(diào)節(jié)至4.0，可能導(dǎo)致FSG部分大分子裂解成較小的片斷無法與ZNP結(jié)合，所有實(shí)驗(yàn)組都出現(xiàn)雙峰，分散性較差[32]。多糖的加入使ZNP粒徑增大，U4和U5粒徑增加的程度較弱，緊接著是U1和U2，U3處理組的粒徑最大且分布較廣泛，這一趨勢(shì)驗(yàn)證了表面疏水性的結(jié)果。已有研究證明，zein與親水性多糖通過非共價(jià)相互作用：靜電、疏水與氫鍵作用生成復(fù)合顆粒[33-34]。表3列出了不同超聲條件預(yù)處理后的zein制備的ZNP-FSG復(fù)合顆粒的粒徑和zeta電位。由于與FSG的絡(luò)合，顆粒粒徑從193.5 nm增加到672 nm。ZNP被包裹后顆粒尺寸的增加可能部分是由于玉米蛋白和亞麻籽膠形成復(fù)合物，也有可能是因?yàn)槎嗵侵g相互聚集所導(dǎo)致的[35]。與對(duì)照組相比，超聲處理組的復(fù)合顆粒粒徑顯著升高，從672 nm升至最高1 366 nm，證明更多的FSG成功附著在蛋白質(zhì)表面；不同超聲處理組之間的粒徑存在明顯差距，代表其表面的多糖數(shù)量存在顯著差異。

由于ZNP與FSG在pH 4.0的水溶液里帶有正負(fù)2種電荷，當(dāng)它們均勻分布在溶液中時(shí)，正負(fù)相吸而結(jié)合。靜電相互作用在蛋白質(zhì)和陰離子多糖的形成復(fù)合物過程中及其穩(wěn)定性程度起重要作用，決定其穩(wěn)定性，并且，外部膠層決定著復(fù)合物顆粒的整體電荷特征[36]。無FSG包覆的天然ZNP的電位是+26.4 mV，經(jīng)FSG包覆后電位變成負(fù)電荷，證明兩者主要由靜電相互作用形成具有較大粒徑的復(fù)合物，此結(jié)論可以通過表3的粒徑變化趨勢(shì)得到驗(yàn)證。在超聲波預(yù)處理?xiàng)l件為U1時(shí)，ZNP-FSG復(fù)合顆粒的電位顯著降低至-36.9 mV，代表有部分多糖包裹在蛋白質(zhì)表面，中和本身帶有的正電荷。隨著超聲處理強(qiáng)度增加，電位絕對(duì)值不斷升高。結(jié)合分析表2中超聲預(yù)波處理后ZNP所帶電荷數(shù)值，可以得出，ZNP所帶正電荷越多，結(jié)合陰離子多糖的能力越強(qiáng)，更多的負(fù)電荷亞麻籽膠包裹在表面，導(dǎo)致ZNP-FSG復(fù)合粒子表面負(fù)電荷量越高。由表3可知，超聲波預(yù)處理?xiàng)l件為U3時(shí)，ZNP在結(jié)合多糖后，其負(fù)電荷絕對(duì)值最高，達(dá)到40.6 mV。蛋白表面正電荷越高，結(jié)合FSG的能力就越強(qiáng)，同時(shí)也解釋了前文中ZNP-FSG復(fù)合粒子粒徑變化的可能原因。

綜上所述，針對(duì)不同超聲波條件下，ZNP-FSG復(fù)合顆粒的粒徑和電位的變化趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)超聲波預(yù)處理對(duì)zein的結(jié)構(gòu)影響可以直接影響到ZNP和ZNP-FSG復(fù)合顆粒的結(jié)構(gòu)、構(gòu)象與顆粒大小，且變化趨勢(shì)與超聲波的超聲時(shí)間和超聲密度相關(guān)。證明超聲波預(yù)處理促進(jìn)更多FSG附著在ZNP的表面，F(xiàn)SG作為親水性多糖可以進(jìn)一步增加疏水性蛋白的表面親水性，使得ZNP-FSG復(fù)合顆粒同時(shí)擁有親水性蛋白質(zhì)和膠體穩(wěn)定性的特征，復(fù)合顆粒的理化性質(zhì)對(duì)Pickering乳液的液滴粒徑分布及體系穩(wěn)定性有著重要的意義。

圖6 不同超聲條件下玉米醇溶蛋白-亞麻膠 復(fù)合顆粒的粒徑及分布Fig.6 Size and distribution of ZNP-FSG composite particles under different ultrasonic conditions

表3 不同超聲條件下玉米醇溶蛋白-亞麻膠 復(fù)合顆粒粒徑及電位Table 3 Size and potential of ZNP-FSG composite particles under different ultrasonic conditions

2.3 乳液性質(zhì)及穩(wěn)定性

2.3.1 乳液外觀及顯微鏡觀察

圖7-a展示了由水相與油相按體積比1∶1均質(zhì)制備的乳液，可以觀察到除了N-ZNP，其他組均未出現(xiàn)分層現(xiàn)象，說明FSG在穩(wěn)定乳液方面較強(qiáng)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[37]。質(zhì)量濃度為5 mg/mL的N-ZNP穩(wěn)定的乳液分層最嚴(yán)重，且底物出現(xiàn)絮凝物，由于玉米醇溶蛋白具有較強(qiáng)的疏水性，無法包裹油滴，只是單純與食用油混合。從每組乳液中間吸取一滴至載玻片上如圖7-b所示，液滴的外觀進(jìn)一步展示了乳液的微觀特點(diǎn)，F(xiàn)SG組的液滴中間為乳液的形態(tài)，而周圍一圈呈現(xiàn)接近于透明的狀態(tài)；N-ZNP的液滴幾乎由油狀物構(gòu)成，摻雜著些許蛋白質(zhì)絮凝物；其他組的液滴都較為完整呈現(xiàn)乳白色，較為穩(wěn)定。

乳液液滴放大4倍和40倍的光學(xué)顯微鏡圖(圖8)與液滴狀態(tài)描述的相一致，雖然FSG可以包裹油滴，但仍然有大量流動(dòng)液體存在于液滴周圍，乳液狀態(tài)處在不穩(wěn)定的邊緣；N-ZNP的顯微鏡圖中看不見任何液滴形態(tài)，食用油中漂浮著少許蛋白絮凝物；未經(jīng)超聲復(fù)合顆粒組(N-ZNP-FSG)與超聲波預(yù)處理組(U-ZNP-FSG)復(fù)合顆粒制備的乳液都呈現(xiàn)完整視野的液滴，液滴大小較為集中，狀態(tài)良好，N-ZNP-FSG由于液滴尺寸較大，被蓋玻片擠壓輕微變形，且液滴分布較為松散。同時(shí)，與對(duì)照組相比，超聲組波的液滴尺寸更小，尤其是U2和U3組，形狀呈近圓形分布緊密，且尺寸大小較為集中。由倒置顯微鏡放大40倍后，發(fā)現(xiàn)不同超聲波預(yù)處理組間ZNP-FSG液滴大小有所差異，對(duì)照組、U1和U5組存在肉眼可見較大的液滴，U2和U3的狀態(tài)和尺寸相近，液滴比較密集，出現(xiàn)層次感。這說明經(jīng)過一定條件的超聲波預(yù)處理的zein形成的ZNP-FSG乳液擁有較小的顆粒、較強(qiáng)的穩(wěn)定性，具體尺寸分布仍需進(jìn)一步測(cè)量分析。

a-Pickering乳液；b-液滴圖7 ZNP-FSG復(fù)合顆粒制備的Pickering乳液及液滴Fig.7 Visual observations of Pickering emulsion and droplets stabilized by ZNP-FSG composite particles

a-液滴放大4倍視野；b-液滴放大40倍視野圖8 ZNP-FSG復(fù)合顆粒制備的Pickering乳液照片 和光學(xué)顯微鏡圖Fig.8 Optical micrographs of Pickering emulsion stabilized by ZNP-FSG composite particles

2.3.2 液滴尺寸及分布

Pickering乳液的穩(wěn)定性很大程度上決定于蛋白質(zhì)顆粒的大小、分布、極性、微觀形貌等。前期研究發(fā)現(xiàn)，不同超聲波預(yù)處理形成的ZNP、ZNP-FSG復(fù)合顆粒的粒徑和表面電位等存在巨大差異(表3)，進(jìn)而影響乳液的穩(wěn)定性。不同超聲條件處理的復(fù)合顆粒對(duì)乳液液滴尺寸如圖9所示。隨著超聲處理的加入(U1)，所制備乳液的粒徑顯著減小，液滴粒徑從原來的76.8 μm降低至最35.8 μm左右,N-ZNP-FSG制備>的乳液液滴具有最大尺寸，其分布的峰較寬，與顯微鏡放大觀察到的現(xiàn)象一致。超聲波預(yù)處理組的ZNP-FSG粒徑分布變化趨勢(shì)與ZNP粒徑相似，均在U3-ZNP-FSG時(shí)獲得最小尺寸以及分布最集中。由此可以說明，在超聲條件為U3∶460 W/cm2-20 min時(shí)，ZNP包裹的FSG親水層較穩(wěn)定，乳化性最強(qiáng)。WAN等[38]的研究表明，由SPI制備的乳液液滴越小其物理穩(wěn)定性越強(qiáng)，因此可以推測(cè)出超聲處理組擁有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，不易出現(xiàn)分層。

圖9 不同超聲波預(yù)處理下的ZNP-FSG復(fù)合顆粒 制備乳液液滴粒徑分布Fig.9 Droplets size distribution of the Pickering emulsion made by ZNP-FSG composite particles under various ultrasonic treatment

此外，由于單獨(dú)FSG和ZNP穩(wěn)定乳液中的油相已經(jīng)大部分釋放，極其不穩(wěn)定，所以不適合測(cè)量尺寸。分析其原因可能是ZNP對(duì)照組蛋白顆粒上的親水性多糖數(shù)量較低，親水面積較少無法包裹小油滴，導(dǎo)致油滴易發(fā)生聚集，粒徑較大。超聲波預(yù)處理增加了zein表面電荷絕對(duì)值，尤其是適宜超聲強(qiáng)度和時(shí)間下(U3)，ZNP-FSG復(fù)合物親水面積顯著增大，乳液滴粒徑減小，更加均一。與此同時(shí)，亞麻籽膠的黏稠性可以有效增加Pickering乳液連續(xù)相的黏度，有利于阻礙液滴間的碰撞和聚并，也阻止油滴的上浮或者水滴的沉降，延緩分層速度，增強(qiáng)了乳液的穩(wěn)定性。

2.3.3 耐高溫穩(wěn)定性

高溫環(huán)境可以加速乳液失穩(wěn)，有利于短期內(nèi)觀察復(fù)合物以及乳液的穩(wěn)定性。熱處理可能會(huì)迫使蛋白質(zhì)分子展開并暴露被埋藏的疏水基團(tuán)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)與多糖之間發(fā)生反應(yīng)并進(jìn)一步形成復(fù)合物[18]。本文研究了在不添加任何物質(zhì)的情況下，熱處理(80 ℃ 30 min)對(duì)Pickering乳液穩(wěn)定性的影響，如圖10-a所示。在相對(duì)較高的溫度處理之后，將所有樣品倒置后僅FSG和N-ZNP組可以完全流動(dòng)，其他組已經(jīng)呈現(xiàn)凝膠狀態(tài)，這說明了ZNP-FSG復(fù)合顆粒經(jīng)高溫處理后形成凝膠顆粒，使乳液流動(dòng)性變差。

a-Pickering乳液正置與倒置；b-液滴放大4倍視野圖10 80 ℃水浴30 min之后乳液照片和光學(xué)顯微圖Fig.10 Visual observations and optical micrographs of emulsion after 80 ℃ water bath for 30 min

如圖10-b所示，對(duì)照組的乳液發(fā)生了顯著的變化，尤其由N-ZNP制備的乳液，經(jīng)加熱后，油相與水相完全分離，蛋白質(zhì)析出并漂浮在油相之中。同時(shí)，F(xiàn)SG的液滴直徑變大，油相析出。這種現(xiàn)象證明了醇溶蛋白的疏水性對(duì)于乳液體系是極其不利的，而FSG屬于大分子乳化劑，雖然同時(shí)具乳化能力和增稠性能，但是受到高溫影響后，原先穩(wěn)定在油滴表面的部分FSG大分子容易脫落，導(dǎo)致乳液失穩(wěn),與陳海華[9]的研究結(jié)果一致。觀察ZNP-FSG復(fù)合顆粒制備的乳液，對(duì)比加熱前后顯微鏡下液滴的大小及分布，發(fā)現(xiàn)高溫處理后乳液液滴分布變得疏松，并且液滴尺寸有了一定增長(zhǎng)，但大部分乳液,尤其是U3組,還保持著均一、較小的液滴，擁有較強(qiáng)穩(wěn)定性,說明了一定強(qiáng)度超聲波預(yù)處理后,ZNP-FSG復(fù)合顆粒制備的乳液擁有抵抗高溫的物理穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

經(jīng)過超聲波預(yù)處理的zein結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化，尤其是高強(qiáng)度超聲增加了α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量，同時(shí)使更多疏水性氨基酸暴露。超聲波預(yù)處理引起的zein的結(jié)構(gòu)變化也使得反溶劑沉淀制備ZNP的過程受到影響，即適當(dāng)?shù)某暡A(yù)處理?xiàng)l件可以顯著降低ZNP的平均粒徑、峰值粒徑，并增加電位絕對(duì)值，顯著提升體系穩(wěn)定性。超聲波預(yù)處理進(jìn)而影響了ZNP與FSG通過靜電相互作用形成的復(fù)合顆粒。超聲預(yù)處理促進(jìn)了ZNP表面電位的升高，從而使得ZNP結(jié)合更多的FSG，導(dǎo)致復(fù)合顆粒的粒徑增大、電位絕對(duì)值增加，復(fù)合顆粒的親水性增加。最后經(jīng)過熱穩(wěn)定性分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)利用ZNP-FSG復(fù)合顆粒制備的乳液無分層析水現(xiàn)象，尤其U3下的液滴形態(tài)幾乎無變化，將其作為乳液穩(wěn)定劑應(yīng)用于需高溫處理的食品加工過程中，能夠有效地抵御液滴的聚集及破裂。總之，超聲波處理提供了一種提高Pickering粒子親水性以及穩(wěn)定性，尤其是熱穩(wěn)定性的物理改性方法。