沈清清，趙 芳，胡 彥，吳風(fēng)志，胡國賢

（1.文山學(xué)院 三七醫(yī)藥學(xué)院，云南 文山 663099；2.文山學(xué)院 冶金與材料學(xué)院，云南 文山 663099）

石漠化是一種嚴(yán)重的地質(zhì)生態(tài)災(zāi)害，會導(dǎo)致土地生產(chǎn)力下降、植被退化、當(dāng)?shù)刎毨鏀U大等環(huán)境問題和社會問題[1]。云南省的石漠化現(xiàn)象在全國范圍內(nèi)屬于較為嚴(yán)重的，其中文山州的石漠化程度在云南省較為嚴(yán)重和典型，全州巖溶面積1 352 451.1 hm2，其中47.84 %屬于石漠化土地，面積為646 967.7 hm2[2]。

目前我國持續(xù)開展了許多植被恢復(fù)治理項目[3-5]，獲得了系列成功的治理模式和技術(shù)，但至今存在生態(tài)效應(yīng)不穩(wěn)定、治理成效鞏固困難的特點[6-7]。因此解決問題的根本在于優(yōu)化喀斯特石漠化區(qū)域環(huán)境，提高植物對土壤的適應(yīng)能力。改善土壤環(huán)境，使之利于植物的生長，除需要改良土壤的物理和化學(xué)性質(zhì)外，土壤中的微生物結(jié)構(gòu)與組成是另一關(guān)鍵要素，生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性也與之密切相關(guān)。真菌是土壤中的一大類群，無論是在維持植物的生長、發(fā)育、抗逆性方面，還是分解土壤中有機質(zhì)和改良土壤方面都屬于主要的功能類群[8-10]。目前國內(nèi)外對土壤真菌多樣性的研究頗多，但對于石漠化土壤中真菌多樣性的研究近年來才開始興起[11-13]，相關(guān)報道比較有限。本研究采用第二代Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)[14-15]對文山市喀斯特石漠化土壤真菌進(jìn)行鑒定，分析真菌的多樣性信息及分布格局，探明真菌優(yōu)勢菌群，旨在豐富人們對石漠化土壤真菌群落特征的認(rèn)識，為石漠化區(qū)域退化土壤的修復(fù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

經(jīng)野外實地考察，選擇文山市3 個典型的喀斯特石漠化樣區(qū)作為樣本（1 號樣本、2 號樣本和3號樣本）采集地點（GPS 定位信息：23°33′99″ N，104°30′44″ E；23°37′6″ N，104°26′62″ E；23°36′74″N，104°21′86″ E），每個樣本采集地點隨機選擇植物生長相對茂盛的3 個樣方（樣方間距約50 m），按照“五點混合法”和“抖落法”采集植物根際土壤。將采集到的全部土樣迅速帶回實驗室進(jìn)行處理，剔除植物殘根、石粒和其他可能雜物，之后將每個樣區(qū)里采集的3 個樣方土壤各取10 g 充分混勻裝入已滅菌采樣袋，置于-80 ℃ 超低溫冰箱保存。

1.2 土壤DNA提取和PCR擴增

土壤DNA 提取選用QIAGEN DNeasy PowerSoil Kit 12888-100 試劑盒，按照說明書的相關(guān)步驟提取土壤總DNA。

PCR 擴增序列為18S rDNA V4-V5 區(qū)；引物為ITS1F 和ITS2R（ 序 列 分 別 為5′-CTTGGTCA TTTAGAGGAAGTAA-3′和 5′-GCTGCGTTCTTCATCG ATGC-3′）；擴增條件為預(yù)變性（95℃，2 min）、變性（94 ℃，20 s）、退火（55 ℃，40 s）、延伸（72 ℃，1 min，35 個循環(huán)）、終延伸（72 ℃, 2 min）。每個樣本3 個重復(fù)，將同一樣本擴增產(chǎn)物進(jìn)行混合。

1.3 測序數(shù)據(jù)處理

將樣本PCR 產(chǎn)物送上海天昊遺傳分析中心構(gòu)建 Miseq 文庫，雙向熒光競爭性PCR 定量，毛細(xì)管電泳文庫檢測，文庫合格后，采用Illumina Miseq 2X300bp 雙向測序, 每個樣本不低于50 000 clean reads；使用FLASH 軟件對miseq 雙末端測序數(shù)據(jù)合并，利用特異性引物信息去除barcode 序列，處理抽提有效序列，統(tǒng)計長度分布。為了進(jìn)一步保證序列準(zhǔn)確性，過濾后引物超過2 個堿基的錯配，丟棄長度短于200 bp 和總堿基錯誤率高于1 的序列；為減少分析過程的冗余計算，合并重復(fù)序列后提取非重復(fù)序列，使用軟件UPARSE[16]去除其中的Chimeric序列，經(jīng)以上質(zhì)控后獲得clean reads。根據(jù)不低于97%相似性的標(biāo)準(zhǔn)將clean reads 歸并到相關(guān)OTU 中。

1.4 統(tǒng)計與生物信息學(xué)分析

分析并計算不同樣本中微生物的多樣性評估指數(shù)即ace，chao，simpson，shannon，coverage 的值（采用平臺：mothur）；將樣品序列與silva 數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行檢索和比對，抽提樣品中OTUs 在界、門、綱、目、科、屬、種6 個分類階元上的物種分類信息；采用R語言分析群落組成和結(jié)構(gòu)以及優(yōu)勢菌群。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性

通過計算各樣本中α 多樣性指數(shù)統(tǒng)計量可以獲得描述和評價真菌多樣性信息。圖1 為稀釋性曲線，隨機抽取的個體和物種數(shù)可以說明樣本的取樣大小是否合理，如圖1 所示，1、2 和3 號土壤樣本的稀釋曲線隨著樣品序列數(shù)的增加均趨于平緩，意味著增加測序數(shù)量不會產(chǎn)生新的物種，測序取樣數(shù)量和深度能合理反映樣本土壤真菌群落情況。

圖 1 土壤樣本中OTU稀釋性曲線

3 個典型樣本獲得的總有效序列條數(shù)和經(jīng)過處理優(yōu)化后的總序列數(shù)分別為 185 511 和 168 677，序列長度的平均值均為 452.7 bp。1 號樣本中含 56 234 條序列，去冗余等處理后的序列聚類獲得 262 個分類單元（OTU）；2 號樣本比1 號樣本少5 994 條序列，去冗余等處理后的序列聚類獲得 252 個分類單元（OTU）；3 號樣本比1 號樣品少5 075 條序列，去冗余等處理后的序列聚類獲得 253 個分類單元（OTU）。如表1 所示，指示類群豐度的指數(shù)Ace 最低值為270.363 147 7±63.625 272 2（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，下同），最高值為273.197 138 0±80.477 988 6，同樣指示類群豐度的指數(shù) Chao 最低值為270.889 883±79.831 098 8，最高值為274.598 920 7±46.592 737 7；指示類群多樣性的指數(shù) Shannon 最低值為3.008 140 0±0.000 214 8，最高值為3.059 505 0±0.000 194 9，同樣指示類群多樣性的指數(shù) Simpson 最低值為0.092 392 0±0.000 001 5，最高值為0.101 014 3±0.000 214 8。以上數(shù)據(jù)均顯示3 個樣本間的真核微生物豐度與真核微生物群落多樣性差異不顯著（P＞0.05），表明文山市石漠化土壤中真核微生物的豐度和多樣性特征比較均態(tài)化。另外，從表1 中還可獲得樣本所測序列覆蓋率的信息，三個樣本的Coverage 值均在99%以上，如此之高的覆蓋率表明所測結(jié)果與土壤樣本中真實菌群高度一致，統(tǒng)計學(xué)上具有較高的可信度。

表1 不同土壤樣本中α 多樣性指數(shù)分析

2.2 土壤中的真核微生物群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 真核微生物群落結(jié)構(gòu)分析

OTUs 與silva 庫中的參考序列比對分析后進(jìn)行分類學(xué)鑒定，從6 個分類階元層面（界、門、綱、目、科、屬、種）分析真核微生物的組成及豐度。從3 個樣本獲得的序列共歸入20 門43 綱65 目58 屬。從門階元層上看屬于真菌的有7 個門，分別是：子囊菌門（Ascomycota，占總菌群的69.23%～71.07%）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota，占總菌群的7.91%～ 8.61%）、芽枝霉門（Blastocladiomycota）、壺菌門（Chytridiomycota，占總菌群的7.20%～8.47%）、球囊菌門（Glomeromycota，占總菌群的3.40%～3.59%）、毛霉菌亞門（Zoopagomycotina，占總菌的0.13%～ 0.29%）、接合菌門（Zygomycota，占總菌群的3.65%～4.11%），其中相對豐度最高的是子囊菌門。從綱階元層上分析子囊菌門門下的座囊菌綱（Dothideomycetes，占總菌群的36.67% ～37.96%）和糞殼菌綱（Sordariomycetes，占總菌群的20.22%～21.50%）豐度占比最高，其余5 個綱所占豐度稍低，為散囊菌綱（Eurotiomycetes，占總菌群的7.64%～8.79%)、壺菌綱（Chytridiomycetes，占總菌群的6.63%～7.64%）、傘菌綱（Agaricomycetes，占總菌群的5.43%～5.83%）、球囊菌綱（Glomeromycetes，占總菌群的3.40%～3.59%）、銀耳綱（Tremellomycetes，占總菌群的1.72%～2.39%），以上菌綱總和占比達(dá)84.57%～84.79%，其余占比較低，且其中有9.33%～10.39%為沒有分類信息或未入庫的序列。從目階元層面上看座囊菌綱下所屬的格孢腔目（Platyophryid，占總菌群的20.67%～21.71%）和煤炱目（Capnodiales，占總菌群的14.29%～15.66%），以及糞殼菌綱下所屬的肉座菌目（Hypocreales，占總菌群的19.24%～20.38%）屬于豐度占比較高的菌目，另外散囊菌綱下所屬的刺盾炱目（Chaetothyriales）和散囊菌目（Eurotiales）分別占總菌群的5.35%～6.76%和1.93%～2.16%、壺菌綱下所屬的壺菌目（Chytridiales）和小壺菌目（Spizellomycetales）分別占總菌群的3.36%～3.83%和1.08%～1.91%、傘菌綱下所屬的雞油菌目（Cantharellales）和傘菌目（Agaricales）分別占總菌 群 的2.65% ～3.24%和2.53% ～2.87%、 球 囊菌綱下所屬的球囊霉目（Glomerales）占總菌群的3.32%～3.48%。從屬分類水平上看，不能明確其分類信息和未培養(yǎng)水平的核酸序列達(dá)52.70%～53.98%，表明石漠化土壤中存在大量有待挖掘和開發(fā)利用的微生物資源。在屬階元層上已確定分類地位的核酸序列中，Boeremia（占總菌群的15.10%～16.88%）和芽枝霉屬（Cladosporium，占總菌群的13.25%～14.28%）具有絕對的優(yōu)勢地位，總和最高達(dá)31.16%。旋孢腔菌屬（Cochliobolus，占總菌群的3.66%～6.12%）、絲核菌屬（Rhizoctonia，占總菌群的2.70%～3.24%）、傘菌屬（Agaricus，占總菌群的2.53%～2.87%）、球腔菌屬（Mycosphaerella，占總菌群的1.04%～1.43%）4 個屬相對豐度總和在9.93%～14.42%范圍，剩余各屬相對豐度均低于1%。

2.2.2 樣方土壤中AM真菌分布狀況

與AM 真菌權(quán)威網(wǎng)站Arthur Schü?ler（http://www.amf-phylogeny.com）發(fā)布的AM 真菌分類信息比對后，如圖2 所示3 個樣本土壤中均存在AM 真菌分布，但其類型較為單一，目前已發(fā)現(xiàn)的 AM 真菌有4 目11 科27 屬，接近 300 種[17-18]。而本研究中鑒定到科級分類水平的僅有球囊霉目（Glomerales）的球囊霉科（Glomeraceae），其相對豐度占總reads 的2.27 ～2.39%，球囊霉目中有1.05 ～1.09%的reads 未能鑒定到科。屬級分類水平上也未能獲得AM 真菌的相關(guān)信息。

圖 2 不同土壤樣本群落結(jié)構(gòu)分析

2.3 優(yōu)勢與共有菌種分析

維恩圖（venn）可以反映環(huán)境樣品的相似性及重疊情況。圖3 為以O(shè)TU 97%相似水平得到的venn 圖。

圖 3 土壤樣本微生物群落OTU 維恩圖

如圖3 所示，所有土壤樣品中全部OTU 數(shù)目是314，其中3 個樣本土壤中共有的OTU 為196 個，占總OTU 數(shù)目的62.42%，表明3 個樣本的土壤樣品中含有大量的相似物種，相似性較大。1 號樣本土壤中特有的OTU 是22 個，2 號樣本土壤中特有的0TU 是19 個，3 號樣本土壤中特有的OTU 是16個，分別占對應(yīng)土壤樣品總OTU 的8.40%、7.54%、6.32%。共有的196 個OTU 中能確定種屬分類地位的有48 個，大部分OTU 的分類信息不能明確。其中優(yōu)勢菌種是Boeremia exigua var. exigua（占總菌群的15.1%～16.88%）和臘葉芽枝霉（Cladosporium herbarum，占總菌群的13.25%～14.28%），另外除Bipolaris sorokiniana（占總菌群的3.66%～6.12 %）、Agaricus bisporus（占總菌群的2.53%～2.87 %）、Rhizoctonia solani（占 總 菌 群 的2.21% ～2.9 %）、Ramularia endophylla（占總菌群的1.04%～1.43 %）4 個物種的相對豐度在1%以上外，其余42 個OTU的相對豐度均小于1%。

2.4 組間群落結(jié)構(gòu)差異分析

Heatmap 熱圖分析如圖4 所示分別從門和屬兩個階元層上對樣品的分類單元（OTU） 類型進(jìn)行聚類，結(jié)果顯示1 和2 號樣本中土壤真核微生物的組間差異相對較小，兩者與3 號樣本土壤比在物種組成上存在一定差異。PCA 分析如圖5 所示不同樣本出現(xiàn)分散或聚集的分布情況，PC1 軸解釋的差異性為24.01%，PC2 軸解釋的差異性為75.99%。主成分分析的目的在于分析確定樣本中影響其真核微生物分布與結(jié)構(gòu)的主要因素，從圖中各樣本與PC1、2兩軸之間的距離遠(yuǎn)近可判定：影響1 號樣本真核微生物分布與結(jié)構(gòu)的主要因素是PC2，影響2 號樣本真核微生物分布與結(jié)構(gòu)的主要因素是PC1，3 號樣本受PC1 和PC2 兩個主成分的影響均不顯著。1、2和3 號3 個樣本沒有聚集在一起且距離較遠(yuǎn)，表明三者組間差異較大。

圖 4 土壤樣本heatmap分析圖

圖 5 不同土壤樣本PCA分析

3 討論

土壤中蘊含著豐富和大量的微生物資源，其中真菌是土壤微生物中重要的一類成員，包括接合菌、擔(dān)子菌、子囊菌、壺菌、球囊菌等，其中一般以子囊菌和擔(dān)子菌類群居多[10]，有學(xué)者認(rèn)為盡管不同土壤生境中微生物群落的整體組成差異可能較大，但優(yōu)勢菌群存在相似度較高的情況[19]。 近年來國內(nèi)的諸多研究也表明植物根際的優(yōu)勢菌群屬子囊菌和擔(dān)子菌。如陳秀波等[20]采用基于ITS 序列的Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)，分析涼水國家級自然保護(hù)區(qū)的不同林型紅松林土壤真菌群落組成和多樣性，這些國內(nèi)外的研究結(jié)果表明在已知真菌類群中，子囊菌門和擔(dān)子菌門為優(yōu)勢菌門。 郭雄飛[21]以20 年生刨花潤楠人工林為研究對象，分析了刨花潤楠根系、根際土壤以及非根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示子囊菌門和擔(dān)子菌門真菌為排名前兩名的優(yōu)勢菌群。艾葉[22]等為研究竹葉蘭（Arundina graminifolia）根系共生真菌的群落結(jié)構(gòu)及對寄主的營養(yǎng)作用，采用高通量測序技術(shù)對野生竹葉蘭根圍土壤、根表、根內(nèi) 3 個生態(tài)位真菌的種類鑒定后發(fā)現(xiàn)豐度排名最高的前20 種真菌僅分布在子囊菌門和擔(dān)子菌門?？λ固厥瘏^(qū)域的土壤屬劣質(zhì)土壤，無論是從物理性質(zhì)（粘度、結(jié)構(gòu)、干濕度、可塑性等）還是化學(xué)成分（酸堿值、營養(yǎng)等）上均已極大程度的惡化。這樣的土壤條件下，植物根際土壤的優(yōu)勢菌群情況如何？本研究的鑒定結(jié)果顯示典型樣本中子囊菌門占比最高，達(dá)69.23%～71.07%， 而相對豐度排第二的為擔(dān)子菌門，但其占比僅為7.91%～8.61%。這一結(jié)果與段倩倩等[23]和黃化剛等[24]的研究結(jié)果較為一致, 而與何敏紅[13]等鑒定的中度石漠化土壤中擔(dān)子菌門相對豐度最大（59.7%）的結(jié)果差異較大。不同類群的真菌在土壤中功能有顯著差別，其中擔(dān)子菌與子囊菌在凋落植被分解過程中的角色就不同，擔(dān)子菌對木質(zhì)化成分較高的植物碎屑分解力較強，而從屬腐生菌類群的子囊菌主要功能為分解植物殘體和降解有機質(zhì)[25,26]，本研究中土壤樣本采集區(qū)主要植物為草本植物，凋落物中木質(zhì)素含量較少，因此對于子囊菌的生長和繁殖是有利條件，另外子囊菌真菌適應(yīng)性也較為廣泛[27]，推測可能是樣本中子囊菌占較高豐度的主要因素。近年來對退化土壤的研究報道中除未知菌種外，青霉屬（Penicillium）和鐮刀菌屬（Fusarium）的菌種屬較為常見的優(yōu)勢菌種[11,28-30]，本次研究樣本中也含有大量的未鑒定的真菌類群，但較特別的是，其優(yōu)勢菌種為Boeremia exigua var. exigua 和臘葉芽枝霉，這一結(jié)果未見相似報道，Boeremia exigua var. exigua 和臘葉芽枝霉在文山石漠化土壤中的特有性對該區(qū)石漠化土壤的修復(fù)與植被生長是否存在特殊意義，有待進(jìn)一步研究。

AM 真菌生態(tài)適應(yīng)性強，可存在于各種生態(tài)環(huán)境中且物種多樣性豐富，甚至在干旱、貧瘠、酸堿失衡等惡劣與退化生境中AM 真菌也廣泛分布，對這些區(qū)域的生態(tài)恢復(fù)與重建具有明顯的促進(jìn)作用。國內(nèi)外的諸多研究數(shù)據(jù)顯示喀斯特石漠化地區(qū)AM 真菌多樣性與豐富度均較高于非喀斯特對照地，原因可能是石漠化生態(tài)系統(tǒng)長期相互選擇的結(jié)果[31-33]。 然而，本研究中3 個典型樣本中檢測到的球囊菌門菌群（AM 真菌類群）相對豐度較低，為3.40%～3.59%，其類型也比較單一，僅檢出歸屬球囊霉目下的AM 真菌。分析原因可能與采樣區(qū)植物類型和生長情況相關(guān)，3 個土壤采樣區(qū)植物群落結(jié)構(gòu)特征基本相似，主要生長植物類型為草本，少量灌木，不生長喬木，且植物生長稀疏，密度低。Hiiesalu 等[34]研究指出 AM 真菌物種豐度與植物物種豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系。許多研究還發(fā)現(xiàn)AM 真菌具有強的植物偏好性[35]。因此推測采樣區(qū)石漠化土壤持續(xù)退化可能與AM 真菌的影響有關(guān)。眾所周知，AM 真菌的侵染起源于土壤[36]，土壤中AM 真菌的多樣性亦是保證植物菌根生成和生長的必要前提。因此退化土壤中施入多種類型的AM 真菌可能成為治理石漠化的有效手段。