陳云，謝軍，黃才斌，葉菁,2*

1.贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341001；2.江西中醫(yī)藥大學，南昌 330004

炎癥性腸?。↖nflammatory Bowel Disease，IBD）是一種病因不明的慢性非特異性結腸炎癥疾病，包括潰瘍性結腸炎（Ulcerative Colitis，UC）與克羅恩?。–rohn's Disease，CD），其中UC 患者臨床常表現出反復性腹痛、腹瀉、黏液濃血便等癥狀，該病遷延不愈，嚴重影響患者生命質量［1,2］。臨床治療UC 的傳統(tǒng)藥物如柳氮磺胺吡啶水楊酸制劑、免疫抑制劑及糖皮質激素等雖具有明顯療效，但臨床副作用較多［3］。美沙拉嗪是治療IBD 的常用一線藥物，對于初發(fā)型輕中度病變的治療，療效明顯；隨著基礎研究的深入，發(fā)現其保護結腸上皮完整性與UC發(fā)生發(fā)展關系密切［4］。因此，本研究探討美沙拉嗪對UC 模型大鼠腸黏膜完整性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠40 只，雌雄各半，體重（200±20）g，由贛南醫(yī)學院實驗動物中心提供。大鼠飼養(yǎng)于贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院SPF 級動物實驗中心，溫度20～25 ℃，相對濕度50～70%，自由飲食飲水，12 h/12 h 晝夜節(jié)律適應性飼養(yǎng)1 周后進行造模實驗。

1.2 試劑及儀器

5%的2,4,6－三硝基苯磺酸（Trinitro-Benzene-Sulfonic Acid,TNBS；美國Sigma 公司）；美沙拉嗪緩釋顆粒劑（法國愛的發(fā)制藥公司，規(guī)格：0.5 g×10袋）；10%水合氯醛（上海安妍生物有限公司）；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；石蠟切片機、攤片機、生物組織包埋機（德國萊卡公司）；生物熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 造模方法 采用TNBS/乙醇化學法誘導形成UC大鼠模型。對照組、結腸炎模型組、美沙拉嗪低劑量組、高劑量組，每組10 只，造模前均禁食1 d。用10%的水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，隨后用聚丙烯管輕輕插入肛門，深度約8 cm，緩慢注入TNBS/乙醇混合溶劑（100 mg/kg），捏緊肛門5 min 左右，化學法誘導形成急性UC。造模7 d 后，隨機抽取2 只大鼠解剖觀察，病理結果顯示有小潰瘍面形成、充血水腫、炎性細胞浸潤，提示造模成功。造模后24 h分組灌胃治療，對照組、結腸炎模型組給予0.9%生理鹽水，而美沙拉嗪低劑量組、高劑量組分別給予美沙拉嗪（100、150 mg/kg）灌胃治療。

1.3.2 標本采集 每天記錄大鼠一般情況，并進行疾病活動指數（Disease Activity Index，DAI）評分。連續(xù)治療14 d 后，大鼠禁食24 h，稱重后麻醉，處死大鼠，顯微鏡觀察結腸病變情況及進行結腸粘膜損傷指數（Colon Mucosal Damage Index，CMDI）評分；隨后取結腸病變部位與4%多聚甲醛溶液中固定，再脫水透明處理，接著行石蠟包埋、組織切片、HE 染色、封片等處理，置于生物倒置顯微鏡觀察組織有無潰瘍面、結腸絨毛排列、充血及炎癥細胞浸潤等病理變化，檢測結腸上皮厚度，行組織學損傷指數（Tissue Damage Index，TDI）評分。

1.3.3 觀察指標 采用Olympus 顯微鏡觀察HE 染色切片上的結腸黏膜潰爛處，轉換高倍鏡觀察并取5個視野，用專業(yè)圖像分析軟件測量計算再生黏膜厚度與黏膜肌缺損寬度的平均值。

1.4 判定標準

DAI 評分包括體質量下降分數、便血分數及大便性狀分數，具體評分細則參考文獻［5］。CMDI評分標準細則見文獻［6］。TDI 評分標準見文獻［7］。TUNEL 法檢測細胞凋亡情況，凋亡細胞為棕色，正常細胞為藍紫色。細胞凋亡指數（AI）=（凋亡細胞數/細胞總數）×100%。

1.5 統(tǒng)計學方法

運用SPSS 22.0 進行數據分析。計量資料以均數±標準差（）描述，進行正態(tài)性與方差齊性分析；對正態(tài)分布數據，多組計量資料比較用One-Way ANOVA 分析，兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況及組織病理學改變情況比較

結腸炎大鼠給予美沙拉嗪灌胃治療2 周后，大鼠體重增加，毛色有光澤，活動增加，糞便有顆粒狀或條狀，癥狀明顯改善。結腸炎模型組大鼠經TNBS 誘導后第6 d 出現腹瀉、體質量減輕及稀便；大鼠結腸組織出現腸管變粗和腸壁增厚，與腹腔內組織粘連，結腸黏膜明顯充血水腫，甚至形成糜爛和潰瘍，見圖1。顯微觀察可見模型組大鼠結腸組織見大量炎癥細胞浸潤，炎癥累及結腸腸壁全層，腸黏膜腺體被破壞且分布雜亂，較多部位有糜爛以及潰瘍形成，見圖2。第14 d 天后模型組大鼠表現為慢性炎癥，大量淋巴細胞浸潤，可見朗格漢斯巨細胞、肉芽腫形成、鋪路石樣改變。

2.2 各組大鼠DAI、CMDI、TDI 平均評分情況比較

使用TNBS/乙醇混合溶劑灌腸給藥后，模型組大鼠DAI、CMDI 和TDI 評分顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而美沙拉嗪低劑量組、高劑量組的上述評分明顯低于結腸炎模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠DAI、CMDI、TDI平均評分情況比較（，n=10） 分

表1 各組大鼠DAI、CMDI、TDI平均評分情況比較（，n=10） 分

注：與對照組相比，aP＜0.05；與結腸炎模型組相比，bP＜0.05；與美沙拉嗪低劑量相比，cP＜0.05。

2.3 各組大鼠再生黏膜厚度與黏膜肌缺損寬度比較

美沙拉嗪低劑量組與結腸炎模型組相比，結腸黏膜層缺損未出現明顯的再生修復，無明顯差異（P＞0.05）；美沙拉嗪高劑量組與結腸炎模型組相比，結腸黏膜層缺損有不同程度的修復與改善，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠再生黏膜厚度與黏膜肌缺損寬度比較（，n=10）

表2 各組大鼠再生黏膜厚度與黏膜肌缺損寬度比較（，n=10）

注：與結腸炎模型組相比，aP＜0.05；與美沙拉嗪低劑量組相比，bP＜0.05。

2.4 各組結腸上皮細胞凋亡情況比較

TUNEL 染色結果顯示，對照組結腸上皮細胞僅有少數凋亡，模型組結腸上皮細胞凋亡數量較多，而美沙拉嗪組結腸上皮細胞凋亡數量較模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

UC 是一種難以治愈的慢性非特異性炎癥性疾病，病變部位集中于結直腸黏膜及黏膜下層，其臨床常表現為腹痛腹瀉、黏液膿血便［8］。該病病理機制尚不十分明確，研究認為其可能與感染因素、遺傳因素、免疫調節(jié)劑、個人心理因素等相關，導致患者腸道黏膜生物屏障損壞改變，引起免疫調節(jié)紊亂，最終造成機體炎癥性損傷，因此保護腸黏膜完整性對治療UC 具有重要作用［9］。美沙拉嗪為臨床治療UC 一線用藥，5-氨基水楊酸是其有效成分，半衰期約為1 h，能在結腸部分有效蓄積，對結腸前列腺素、過氧化物酶及黏膜白三烯均有一定抑制作用，能抑制巨噬細胞遷移至結腸病灶部位，發(fā)揮抗炎、消除損傷因子作用［10,11］；研究表明，美沙拉嗪可有效減少因使用柳氮磺胺吡啶所產生的的胃腸道反應、肝腎損傷等不良反應［12］。

在疾病機制研究中，建立良好的腸道炎癥動物模型對研究UC 發(fā)病機制及美沙拉嗪的療效具有重要意義。常用TNBS/乙醇法誘發(fā)大鼠體內免疫與炎癥反應建立潰瘍性結腸炎動物模型，其病理表現與人類UC 相似。本研究發(fā)現，TNBS 造模成功后，結腸炎模型組大鼠活動狀況及體質量下降明顯，CMDI 評分升高且結腸組織出現明顯損傷，符合UC 臨床表現。經治療后，美沙拉嗪組大鼠的一般狀況與體質量均有明顯上升，DAI、CMDI 和TDI評分明顯降低，鏡檢結腸總體形態(tài)與HE 染色呈現的結腸再生黏膜厚度與黏膜肌缺損寬度均有明顯改善，同時結腸上皮細胞凋亡數量明顯減少，美沙拉嗪高劑量組治療效果更佳，提示美沙拉嗪可顯著改善UC 大鼠的病理損傷情況，保護結腸黏膜完整性，發(fā)揮治療潰瘍性結腸炎作用。

綜上所述，美沙拉嗪能顯著改善TNBS 誘導的潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織形態(tài)及病理變化，通過對結腸黏膜屏障的保護、腸上皮細胞的凋亡及免疫失衡的調節(jié)作用，發(fā)揮治療UC 作用。