徐露娟，洪永貴，宋學(xué)坤，郭勝男，曹 恒，溫艷艷

1.安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科，河南 安陽(yáng) 455000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)健康大數(shù)據(jù)與生物醫(yī)學(xué)信息學(xué)實(shí)驗(yàn)室

世界范圍內(nèi)食管癌發(fā)病率在36種癌癥中排第7位，死亡率排第6位，而中國(guó)食管癌發(fā)病率為全球前五，遠(yuǎn)高于世界平均水平[1]。多數(shù)食管癌患者確診時(shí)已為中晚期，手術(shù)及放化療效果較差，導(dǎo)致預(yù)后極差、生存率較低[2]。微小RNA是一類高度保守的內(nèi)源性小型非編碼調(diào)控核糖核酸，Ansari等[3]發(fā)現(xiàn)，miR-93在食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)腫瘤組織中表達(dá)顯著高于非腫瘤組織，認(rèn)為miR-93可能在ESCC中發(fā)揮重要作用，miR-93可用作ESCC的潛在生物標(biāo)志物。Xie等[4]發(fā)現(xiàn)，miR-144在食管癌患者唾液中的表達(dá)水平較健康對(duì)照組上調(diào)。Du等[5]研究認(rèn)為，miR-144在食管癌患者唾液中可能靶向Notch同源物1，已知Notch同源物1作為心臟特異性靶標(biāo)可引起心臟異常，在右心室形態(tài)發(fā)生改變過程中有一定作用[6]。但miR-93、miR-144表達(dá)情況與食管癌患者預(yù)后關(guān)系的相關(guān)研究較少，因此本研究針對(duì)miR-93、miR-144在食管癌患者血漿中的表達(dá)水平，探討二者與食管癌患者預(yù)后情況的關(guān)系，以期未來可對(duì)食管癌預(yù)后評(píng)估提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2017年6月至2019年6月經(jīng)本院檢查并確診為食管癌的患者64例作為觀察組，男35例，女29例，年齡(49.21±8.13)歲(45～55歲)；按照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)/國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)關(guān)于食管癌的TNM分期系統(tǒng)(第八版)[7]對(duì)患者進(jìn)行TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期31例。另選取同期在本院體檢的健康者60名作為對(duì)照組，男33例，女27例，年齡(47.25±9.51)歲(43～54歲)。兩組患者性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。觀察組入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)診斷為食管癌；(2)入組患者均行食管癌根治術(shù)，且就診前未行手術(shù)、放射、化療或激素治療；(3)患者腫瘤為原發(fā)；(4)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)心、腦、腎等重要器官功能障礙；(2)急性、亞急性或隱性感染性疾?。?3)凝血系統(tǒng)障礙，有出血疾病者；(4)合并其他部位腫瘤疾病者。所有受試者均對(duì)本研究知情同意并自愿簽署知情同意書，本研究獲本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(倫理批號(hào)：201705-12)。

1.2 主要試劑與儀器逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：DEM201-20T)購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；Prime ScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(貨號(hào)：RR037A)及TRIzol試劑(貨號(hào)：JMS12279)均購(gòu)自日本TaKaRa公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀(型號(hào)：MiniAmp)購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本采集：兩組測(cè)試對(duì)象均于早晨空腹采集靜脈血6 ml，肝素抗凝，室溫靜置2 h，4 000 r/min離心10 min，吸取上層淡黃色血漿轉(zhuǎn)移至新離心管中，均于-80 ℃冰箱保存待用。

1.3.2 qRT-PCR法測(cè)定受試者血漿中miR-93、miR-144表達(dá)水平：從-80 ℃冰箱取出血漿樣本，按試劑盒說明書提取血漿總RNA，異丙醇沉淀濃縮后，用75%酒精洗滌，干燥后加入100 μl DEPC水，檢測(cè)所得RNA純度及完整度；按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，產(chǎn)物置于-20 ℃保存。qRT-PCR反應(yīng)(反應(yīng)體系10 μl)：cDNA(50 ng/μl)模板1 μl，SYBR Green PCR Master Mix 4.5 μl，上下游引物各0.4 μl，無(wú)酶水3.7 μl，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行。上下游引物由上海恒斐生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，miR-93、miR-144以RUN6B為內(nèi)參，引物序列見表1，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性6 min；95 ℃ 10 s,60 ℃ 45 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)72 ℃收集熒光。采用2-ΔΔCt法計(jì)算血漿中miR-93、miR-144相對(duì)表達(dá)量。

表1 miR-93、miR-144基因qRT-PCR引物序列Tab 1 qRT-PCR primer sequence of miR-93 and miR-144 genes

1.4 隨訪及預(yù)后評(píng)價(jià)以患者手術(shù)時(shí)間為觀察起點(diǎn)，患者死亡、失訪或最后一次隨訪時(shí)間為終點(diǎn)，通過電話、微信等聯(lián)系方式進(jìn)行隨訪，每30 d隨訪1次，記錄患者死亡原因。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較兩組患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、熱食、食管癌家族史比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 兩組一般資料比較Tab 2 Comparison of general data between two groups

2.2 兩組血漿中miR-93、miR-144表達(dá)水平觀察組血漿中miR-93、miR-144 mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(見表3)。

表3 兩組miR-93、miR-144表達(dá)水平比較Tab 3 Comparison of expression levels of miR-93 and miR-144 between the two groups

2.3ROC曲線分析食管癌患者血漿中miR-93、miR-144表達(dá)水平ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，區(qū)分食管癌患者血漿中miR-93、miR-144高低表達(dá)的截?cái)嘀捣謩e為1.70、2.05，低于截?cái)嘀嫡邽榈捅磉_(dá)組，高于截?cái)嘀嫡邽楦弑磉_(dá)組(見圖1)。

圖1 ROC曲線分析食管癌患者血漿中miR-93、miR-144表達(dá)水平Fig 1 ROC curve analysis of the expression levels of miR-93 and miR-144 in plasma of esophageal cancer patients

2.4 食管癌患者血漿中miR-93、miR-144表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系食管癌患者血漿中miR-93、miR-144表達(dá)水平與年齡無(wú)關(guān)，與TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)(見表4)。

表4 食管癌患者血漿中miR-93、miR-144表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab 4 The relationship between the expressions of miR-93, miR-144 in the plasma and clinicopathological characteristics of esophageal cancer patients

2.5 食管癌患者的預(yù)后比較對(duì)所有食管癌患者進(jìn)行為期6個(gè)月的隨訪，并繪制Kaplan-Meier生存曲線。miR-93高表達(dá)組28例，死亡15例；miR-93低表達(dá)組36例，死亡2例。食管癌患者miR-93低表達(dá)組6個(gè)月生存率明顯高于高表達(dá)組(log-rank值為8.597，P=0.003)；miR-144高表達(dá)組37例，死亡14例；低表達(dá)組27例，死亡3例。食管癌患者miR-144低表達(dá)組6個(gè)月生存率明顯高于高表達(dá)組(log-rank值為7.557，P=0.006)(見圖2～3)。

圖2 食管癌患者血漿miR-93表達(dá)與總生存率的關(guān)系Fig 2 The relationship between the expression of miR-93 and the overall survival rate in patients with esophageal cancer

圖3 食管癌患者血漿miR-144表達(dá)與總生存率的關(guān)系Fig 3 The relationship between the expression of miR-144 and the overall survival rate in patients with esophageal cancer

2.6 影響食管癌患者預(yù)后的多因素分析COX多因素分析顯示，miR-93高表達(dá)、miR-144高表達(dá)、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期是預(yù)測(cè)食管癌患者術(shù)后生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P=0.002、0.024、0.036)(見表5)。

表5 影響食管癌患者預(yù)后的多因素分析Tab 5 Multivariate analysis of prognosis in patients with esophageal cancer

3 討論

食管癌是一種常見的惡性腫瘤，我國(guó)的食管癌90%以上為ESCC，少數(shù)為腺癌。食管癌患者就診時(shí)絕大多數(shù)已屬于中晚期，目前食管癌的主要治療手段仍是手術(shù)、放射治療和化療[8-9]，但治療后病死率及并發(fā)癥發(fā)生率較高，嚴(yán)重影響患者預(yù)后及生存質(zhì)量。研究食管癌預(yù)后相關(guān)生物標(biāo)志物對(duì)提高患者生存率和改善患者生存質(zhì)量有重要意義。

miR-93屬于miR-106b-25 miRNA簇，近年來有研究[10]發(fā)現(xiàn)，miR-93在多種消化道腫瘤組織或細(xì)胞中過表達(dá)，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和治療耐藥性等密切相關(guān)。宋衛(wèi)敏等[11]發(fā)現(xiàn)，miR-93在ESCC組織中的表達(dá)量較對(duì)應(yīng)的癌旁組織明顯升高，miR-93表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)。Fabbri等[12]發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中miR-93高表達(dá)，可通過靶向上調(diào)表皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和白細(xì)胞介素8(interleukin-8，IL-8)的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成。本研究結(jié)果中，與健康對(duì)照組相比，miR-93表達(dá)水平在食管癌患者血漿中高表達(dá)，結(jié)果與Ansari等[3]研究相似，且與食管癌患者TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，說明血漿miR-93水平變化可能與食管癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，miR-93高表達(dá)可能具有促進(jìn)食管癌組織生長(zhǎng)的作用，也調(diào)控某種炎性因子以加重癌細(xì)胞所處炎癥環(huán)境，從而加速食管癌發(fā)展進(jìn)程。

由于miRNAs以穩(wěn)定的形式存在于各種體液包括血液、尿液及糞便中，miR-144則在多種疾病中發(fā)生顯著的變化，使其可以作為多種疾病特異、敏感的生物標(biāo)志物，但目前miR-144的作用靶點(diǎn)及機(jī)制不明確[13]。Shao等[14]發(fā)現(xiàn)，相較癌旁正常細(xì)胞，ESCC細(xì)胞中miR-144表達(dá)降低，在ESCC細(xì)胞系中miR-144轉(zhuǎn)染抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力更強(qiáng)。Xiao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-144過表達(dá)可促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，增強(qiáng)腎透明細(xì)胞癌惡性程度和對(duì)化療藥物耐藥性。有動(dòng)物研究[16]發(fā)現(xiàn)，反流性食管炎大鼠食管黏膜miR-144表達(dá)水平升高，氧化應(yīng)激、黏膜屏障相關(guān)指標(biāo)表達(dá)顯著升高。本研究中miR-144表達(dá)在食管癌患者血漿中呈高表達(dá)，與Sharma等[17]研究顯示miR-144在食管癌患者血清樣本中顯著上調(diào)結(jié)果相一致；且與食管癌患者TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-144可能參與食管癌進(jìn)展，miR-144高表達(dá)或與食管癌黏膜屏障受損、食管癌所導(dǎo)致的炎癥應(yīng)激有關(guān)。miR-93和miR-144均可能參與促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的某種機(jī)制，但尚不清楚是否存在共同的通路或靶標(biāo)，仍需進(jìn)一步研究。

Kaplan-Meier生存曲線顯示，食管癌患者miR-93、miR-144低表達(dá)組6個(gè)月生存率均高于高表達(dá)組，提示miR-93、miR-144高表達(dá)可能是影響食管癌患者死亡發(fā)生的危險(xiǎn)因素。COX多因素分析顯示，miR-93高表達(dá)、miR-144高表達(dá)、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期是預(yù)測(cè)食管癌患者術(shù)后生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示在食管癌發(fā)生過程中miR-93、miR-144高表達(dá)可能預(yù)示食管癌患者術(shù)后生存期短等不良預(yù)后發(fā)生。

綜上所述，miR-93、miR-144在食管癌患者血漿中呈高表達(dá)，與患者TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是影響食管癌患者不良預(yù)后發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但本研究仍存在一些不足，如樣本量過小，未來可通過擴(kuò)大研究對(duì)象群體或延長(zhǎng)研究時(shí)間來解決這一問題；miR-93、miR-144是否存在共同靶標(biāo)或機(jī)制，亟待進(jìn)一步研究。