馮建超 ，周進(jìn)學(xué) ，靳根峰 ，劉勇

（1.河南省新鄭市人民醫(yī)院普外科，河南 新鄭 451150；2.河南省腫瘤醫(yī)院肝膽胰外科，河南 鄭州 450008）

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一,病死率位居所有腫瘤性疾病的第三位。我國是肝癌高發(fā)國家,發(fā)病率、死亡率一直處于較高水平[1,2]。近年來,隨著生活結(jié)構(gòu)的改變及飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整,肝癌的發(fā)病率呈不斷遞增趨勢,嚴(yán)重威脅我國居民的生命健康[3]。肝癌病情初期較為隱匿,臨床癥狀不明顯,且由于肝臟結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),很難區(qū)分肝臟惡性腫瘤及肝臟局灶性良性病變,誤診率較高,只有少數(shù)患者能夠在病情早期得到確診及治療, 多數(shù)患者出現(xiàn)臨床癥狀時(shí),已處于病情的中晚期,失去了最佳的手術(shù)時(shí)機(jī),患者預(yù)后往往較差,復(fù)發(fā)率較高[4]。對肝癌進(jìn)行早診斷、早治療是降低死亡率、提高治療效果的關(guān)鍵。尋找敏感度高、 特異度好的肝癌標(biāo)志物對肝癌的治療具有重要的意義。

微小 RNA （micro RNA,miRNA） 為一類長度19-24 個(gè)核苷酸的非編碼RNA[5],與細(xì)胞的分裂、增殖、分化、凋亡、突變等多種生命活動密切相關(guān)[6],其中 miR-542-3p 位于 X 染色體的 q26.3 區(qū)域。近年來研究提示miR-542-3p 可通過抑制蛋白激酶抑制抑制腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及分化,在多種腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)[7]。miR-542-3p 在肝癌組織細(xì)胞中的含量下調(diào),且影響肝癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲[8],對于血清中miR-542-3p 的報(bào)道較少,在本次研究中以在該院接受治療的60 例患者為研究對象,對患者血清中 miR-542-3P 的水平進(jìn)行分析,進(jìn)而為肝癌的診斷、治療提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取 2019 年 1 月至 2019 年 7 月在該院接受治療的60 例肝癌患者為觀察組, 其中男性患者為32 例,女性患者為28 例,年齡分布為39～72 歲,平均年齡為 49.28±9.68 歲。選取同時(shí)期的健康體檢者60 例,其中男性患者33 例,女性患者 27 例,年齡分布為 41～75 歲,平均年齡為 50.36±8.58 歲,兩組患者在年齡、性別方面無明顯差異（P＞0.05）,具有可比性。所有患者均同意參與本次研究并簽訂相關(guān)文件,該研究經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)會批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn) 年齡≥18 周歲,性別不限；已經(jīng)病理學(xué)檢查確診為肝癌；依從性好,能夠配合完成各項(xiàng)檢查及治療；精神正常,可進(jìn)行正常溝通交流；自愿參加本次研究；臨床資料完整。

排除標(biāo)準(zhǔn) 未被確診的患者；合并心、肝、腎等重要臟器等重大疾病患者；合并其他惡性腫瘤的患者；存在精神障礙的患者；脫落標(biāo)準(zhǔn) 符合納入標(biāo)準(zhǔn),在研究過程中患者出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥或病情不穩(wěn)定,急劇加重的患者；由于各種原因,患者主動退出者或失訪患者；研究期間死亡的患者。

1.2 主要試劑及儀器 主要儀器：實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析儀（TL988-2；濟(jì)南卓隆生物科技有限公司）；高速離心機(jī)（Optima XPN；貝克曼）；miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國 QIAGEN 公司)；RNA 提取試劑盒(上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄儀（StarScript；北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司）；高速勻漿機(jī)（FLUKFA25；德國弗魯克）、超凈工作臺（SW-CJ-1D；蘇州凈化)； miR-106b 上游引物 5’-TAAAGTGCTG -ACAGTGCAGAT-3’（Invitrogen 公司）。

1.3 方法 ⑴血清中總RNA 的提?。呵宄咳§o脈血10ml 置采血管中,靜置10min 后5000r/min 離心10min,棄去沉淀,取 200μl 按照血清 RNA 提取試劑盒說明書提取總血清中RNA, 其余血清放-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。⑵合成cDNA 第一鏈 采用加尾法進(jìn)行合成, 在 16℃ 30 min,42℃ 30 min,85℃ 5 min,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,生成cDNA),結(jié)束后將cDNA 分裝于EP管中,保存于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。⑶?shí)時(shí)熒光定量分析：加入底物、 試劑共計(jì) 20μl, 條件為：95℃15min,92℃ 15s,60℃ 30s,70℃ 35s,共計(jì) 40 個(gè)循環(huán)。對相應(yīng)信號進(jìn)行采集,每個(gè)點(diǎn)的信號取3 次,取平均值,采用Cei-miR-39 作為參照測定miRNA 的相對表達(dá)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本次研究采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),計(jì)量資料采用進(jìn)行表示,組間采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料用%表示,用卡方檢驗(yàn),P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-542-3p 的表達(dá)水平 對兩組血清中的miR-542-3p 水平進(jìn)行分析, 觀察組治療前血清中miR-542 -3p 為 1.76±0.65, 治療后血清中 miR-542-3p 為2.26±0.71, 對照組血清中miR -542-3p水平為3.45±0.96,與對照組相比,觀察組中血清中miR-542-3p 水平明顯偏低, 且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與治療前相比,觀察組血清中 miR-542-3p 水平明顯升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,見表 1。

表1 觀察組及對照組血清中miR-542-3p 水平

2.2 臨床參數(shù)與miR-542-3p 水平 對臨床特征與miR-542-3p 之間的聯(lián)系進(jìn)行分析比較,不同年齡、腫瘤大小組血清組中miR-542-3p 水平無明顯差異（P＞0.05）,不同分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組血清中miR-542-3p 存在顯著差異,分化程度越高、TNM 分期越高、 存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移血清中的miR-542-3p 的水平越低, 且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2。

2.3 ROC 曲線 ROC 曲線分析顯示miR-542-3p區(qū)分肝癌患者與正常人曲線下面積為0.8245（95% CI：0.7483～0.9008）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 值為 0.0283）。當(dāng)截?cái)嘀等?3.026 × 10-3時(shí) ,敏感度與特異度分別為79. 2% 與75. 6%, 對肝癌的診斷具有一定價(jià)值。

表2 不同病理特征與miR-542-3p 水平

3 討論

圖 1 miR-542-3p 的 ROC 曲線

肝癌具有較高的發(fā)病率及致死率,嚴(yán)重威脅人類的生命安全,肝癌的病情進(jìn)展較為隱匿,多數(shù)患者診斷時(shí)已處于晚期,失去了治療機(jī)會,明確癌的影響因素對疾病的防治具有重要意義。但目前的發(fā)病機(jī)制尚不明確,但主要認(rèn)為與年齡、飲食習(xí)慣及環(huán)境等有關(guān),快速、準(zhǔn)確的診斷方法對胃癌的治療具有積極的促進(jìn)作用,早診斷、早治療是治療胃癌的關(guān)鍵[9,10]。相關(guān)研究提示miRNA 在肝癌的發(fā)生及發(fā)展中起著重要作用,可對基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行調(diào)控, 在細(xì)胞的生命活動及癌變中起著重要的作用,miRNA 不僅存在于組織中, 同時(shí)也存在于外周血及其他體液中[11,12]。由于miRNA 與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化關(guān)系密切,可作為血清標(biāo)志物,在腫瘤疾病的診斷及治理中起著重要的作用。對于肝癌的診斷主要依據(jù)影像學(xué)資料及病理檢查, 仍確實(shí)少快速、方便、準(zhǔn)確的檢查方式,miRNA 在肝癌中的診斷及預(yù)后價(jià)值成為研究的重點(diǎn)方向。

miR-542-3p 與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),在諸多腫瘤細(xì)胞中均表達(dá)異常。楊彬、于晶等[13]對微小miR-542-3p 在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其對細(xì)胞增殖遷移能力進(jìn)行了研究分析, 采用FQPCR 對腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織及顱腦外傷患者正常腦組織中miR-542-3p 的表達(dá)水平, 結(jié)果表明miR-542-3p 在腦腫瘤組織中表達(dá)水平明顯降低,且具有抑制腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲的作用。吳寧、陸瑛等[14]對miR-542-3p 在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究分析,對患者癌組織及癌旁組織中miR-542-3p 的表達(dá)水平進(jìn)行了測定,結(jié)果表明癌組織中的miR-542 -3p 水平明顯低于癌旁組織,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-542-3p 水平與口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,可作為疾病診斷的潛在標(biāo)志物。在本次研究中肝癌患者血清中的miR-542-3p 水平明顯低于正常人血清中miR-542-3p 的含量,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這與之前研究具有一致性,miR-542-3p 可降低腫瘤細(xì)胞對血管內(nèi)皮的粘附力,抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,對腫瘤細(xì)胞的增殖、分化具有一定的抑制作用,同時(shí)有助于細(xì)胞的凋亡[15]。在本次研究中腫瘤分化程度越高、TNM 分期越高、 存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移血清中的miR-542-3p 的水平越低,且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-542-3p 在腫瘤的診斷中敏感度高、 特異性好。岑小寧、黃許森等[16]對結(jié)直腸癌患者血清miR-542-3 p 水平進(jìn)行了測定, 結(jié)果表明miR-542-3 p在直腸癌的診斷中,具有較高的靈敏度,特異度,可作為診斷結(jié)直腸癌的生物學(xué)標(biāo)志物. 在本次研究中,ROC 曲線分析顯示miR-542-3p 區(qū)分肝癌患者與正常人曲線下面積為 0.8245 （95% CI：0.7483～0.9008）, 敏感度與特異度分別為79.2% 與75.6%,在肝癌的診治方面具有重要意義。

綜上所述,miR-542- 3P 對肝癌的發(fā)生及發(fā)展具有一定的抑制作用, 在患者血清中表達(dá)水平較低,具有一定的靈敏度、特異度、對肝癌的診斷及預(yù)后具有一定價(jià)值。