黃 穎 任廷遠(yuǎn) 萬(wàn)紅瓊 謝 姣

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2. 貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3. 甘肅省白銀市靖遠(yuǎn)縣科學(xué)技術(shù)局，甘肅 白銀 730600)

目前，酵素產(chǎn)品因具有抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫等功能活性而被廣泛應(yīng)用[1]。已有研究[2-3]表明，酵素保健功能是由多種物質(zhì)共同發(fā)揮作用而成，其中有機(jī)酸不僅因其具有調(diào)整腸道菌群能力、維護(hù)腸道形態(tài)及功能，還具有抗炎、抗氧化作用進(jìn)而可緩解和治療結(jié)腸炎等多種腸道疾病而備受關(guān)注。而食用植物酵素是利用一種或多種益生菌發(fā)酵果蔬、谷物、菌藻、中草藥等而形成的富含多種酶、礦物質(zhì)、維生素、有機(jī)酸及其他代謝產(chǎn)物的固態(tài)和液態(tài)食品[4]。其中，食用植物酵素中有機(jī)酸主要源于植物原料及其他有益菌發(fā)酵，而發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量和種類(lèi)是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，故研究有機(jī)酸與微生物群落共性變化規(guī)律，有助于生產(chǎn)過(guò)程中以有機(jī)酸為指標(biāo)而進(jìn)一步控制酵素中微生物發(fā)酵過(guò)程和品質(zhì)[5]。因此，文章擬主要綜述酵素中有機(jī)酸的組成、發(fā)酵過(guò)程中的變化、生理功能，以期為食用酵素有機(jī)酸評(píng)價(jià)體系及生理功能提供依據(jù)。

1 食用植物酵素簡(jiǎn)介

近年來(lái)，隨著酵素在國(guó)外市場(chǎng)的迅速發(fā)展，中國(guó)酵素市場(chǎng)也開(kāi)始孕育和發(fā)展，植物酵素目前逐步擴(kuò)展到美容護(hù)膚、食品等方面[6-7]。而酵素主要源于果蔬等植物，這類(lèi)食用植物是維生素、有機(jī)酸、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)素的主要來(lái)源，故食用植物酵素中相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)素種類(lèi)和含量豐富，且含糖量低[8]，同時(shí)酵素產(chǎn)品經(jīng)發(fā)酵后其與普通乳制品替代品不同，即食用植物性酵素適用于乳糖不耐癥、牛奶過(guò)敏或純素食者。此外，隨著人們生活水平的逐步提高，健康意識(shí)逐步加強(qiáng)，對(duì)功能性食品的需求也與日俱增。而食用植物酵素具有多種保健功能如抗氧化[9]、美白護(hù)膚[10-11]、增強(qiáng)免疫[12-13]、抗腫瘤[14]、改善腸道菌群[15]等，與大眾的養(yǎng)生理念一致，故食用植物酵素具有廣闊的市場(chǎng)前景。

食用植物酵素發(fā)酵的本質(zhì)是微生物為了獲得能量和維持其合成代謝過(guò)程，降低了原基質(zhì)中碳水化合物和其他大分子含量，積累分解代謝產(chǎn)物，從而不斷改變整個(gè)體系物質(zhì)組成，最后達(dá)到平衡的過(guò)程，故酵素發(fā)酵機(jī)理為各種微生物基礎(chǔ)代謝的活動(dòng)[16-17]。研究[18]表明，食用植物酵素發(fā)酵液在酵母菌、乳酸菌和醋酸菌等轉(zhuǎn)化下生成酯類(lèi)、酸類(lèi)和酚類(lèi)等代謝產(chǎn)物，其風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生明顯變化。目前，植物酵素發(fā)酵過(guò)程中相關(guān)代謝產(chǎn)物主要有：① 多酚類(lèi)，如類(lèi)黃酮、單寧[19]；② 醇類(lèi)，如乙醇、丁醇[20]；③ 有機(jī)酸類(lèi)，如乳酸、蘋(píng)果酸等[21]；④ 酶類(lèi)，如蛋白酶、SOD等[22]；⑤ 氨基酸和維生素等其他物質(zhì)[23-25]，豐富的代謝產(chǎn)物賦予了植物酵素特別的口感和風(fēng)味。其中，有機(jī)酸對(duì)酵素的風(fēng)味起重要作用，有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)為酯類(lèi)形成的前體物質(zhì)，它既能構(gòu)成其他香味物質(zhì)，如金刺梨酵素中有機(jī)酸對(duì)風(fēng)味的重要性?xún)H次于酯類(lèi)，還是重要的味感物質(zhì)使酵素口感豐滿(mǎn)[26]。因此，通過(guò)分析發(fā)酵酵素中有機(jī)酸的組成，可建立食用酵素的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系來(lái)改善和指導(dǎo)酵素中風(fēng)味和品質(zhì)，還可根據(jù)有機(jī)酸的性質(zhì)與作用機(jī)制，建立食用植物酵素有機(jī)酸功能性的評(píng)價(jià)體系[27]。

2 食用植物酵素有機(jī)酸研究進(jìn)展

2.1 食用植物酵素有機(jī)酸的組成

有機(jī)酸是指具有酸性的有機(jī)化合物，大多數(shù)具有酸味植物中含有該類(lèi)物質(zhì)，其具抗氧化、殺菌消炎、維持酸堿平衡、增強(qiáng)抵抗力等作用[28]。目前，有機(jī)酸包括天然有機(jī)酸和合成有機(jī)酸，而植物酵素中富含的大量有機(jī)酸，一方面來(lái)自于植物原料中天然存在的有機(jī)酸，另一方面來(lái)自于發(fā)酵過(guò)程中由于微生物代謝生成的產(chǎn)物。因此，不同植物原料來(lái)源酵素中有機(jī)酸的組成與含量差異較大，而不同菌種發(fā)酵的植物酵素中有機(jī)酸的含量和種類(lèi)存在差異。

張思等[27]研究表明，市售的16種酵素中，由于食品原料和生產(chǎn)工藝不同，酵素產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，含有3～7種有機(jī)酸，且主要為乳酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸和異丁酸，各種有機(jī)酸含量差異較大，對(duì)產(chǎn)品口感和風(fēng)味有重要影響。研究[29]發(fā)現(xiàn)，金佛手酵素在自然發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸組成多樣，主要含L-酒石酸、草酸、乙酸、L-蘋(píng)果酸、抗壞血酸、莽草酸、乳酸、檸檬酸和琥珀酸，乳酸、乙酸、檸檬酸和L-酒石酸為發(fā)酵過(guò)程中含量排名靠前的有機(jī)酸。此外，對(duì)4種不同原料配比的黑果枸杞酵素中有機(jī)酸種類(lèi)及含量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，4種酵素中有機(jī)酸的種類(lèi)及含量不同，黑果枸杞酵素在發(fā)酵過(guò)程中的有機(jī)酸種類(lèi)豐富，共檢出12或13種有機(jī)酸，其中含量較多的是乳酸、γ-氨基丁酸、抗壞血酸、草酸和蘋(píng)果酸[30]。此外，乳酸菌輔助超聲對(duì)葛根汁進(jìn)行發(fā)酵，主要含有乳酸、草酸、抗壞血酸、γ-氨基丁酸、乙酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸等，其中乳酸的酸味溫和適中，口感較好，也是發(fā)酵葛根汁的特征性風(fēng)味酸[31]。綜上，不同植物原料與發(fā)酵方法中，食用植物酵素中有機(jī)酸種類(lèi)不同，但其共有的有機(jī)酸種類(lèi)主要有乳酸、酒石酸、乙酸、丁酸、檸檬酸等，其中乳酸是乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的主要有機(jī)酸，在發(fā)酵過(guò)程中變化最大。此外，發(fā)酵過(guò)程也會(huì)產(chǎn)生一些短鏈脂肪酸，如乙酸、丁酸等，此類(lèi)短鏈脂肪酸對(duì)維持人體健康有益。

2.2 食用植物酵素發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的變化

食用植物酵素發(fā)酵時(shí)會(huì)產(chǎn)生新的有機(jī)酸且其原有的有機(jī)酸含量也會(huì)發(fā)生變化。林靈等[26]研究發(fā)現(xiàn)金刺梨發(fā)酵前后有機(jī)酸種類(lèi)和含量均發(fā)生了顯著變化，有機(jī)酸含量總體升高、種類(lèi)增多，較發(fā)酵前新增了3種有機(jī)酸，分別是乳酸、蘋(píng)果酸和醋酸；此外蘋(píng)果酸相較發(fā)酵前含量增長(zhǎng)了7.51倍，檸檬酸含量較發(fā)酵前增長(zhǎng)了3.42倍。以上有機(jī)酸變化的差異，除與原料密切相關(guān)外，主要源于微生物及各物質(zhì)間的相互轉(zhuǎn)化，使得發(fā)酵各階段處于一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程[32]。微生物主要利用糖酵解、三羧酸循環(huán)和蘋(píng)果酸—乳酸發(fā)酵等途徑，代謝生成乳酸、醋酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、丙酮酸等有機(jī)酸，導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量總體呈上升趨勢(shì)，由于發(fā)酵各時(shí)段微生物數(shù)量與代謝生理不同，所以各時(shí)段的總體增長(zhǎng)趨勢(shì)有所差異[33]。研究[34]發(fā)現(xiàn)，聚類(lèi)分析將百合酵素發(fā)酵過(guò)程分為3類(lèi)，即適應(yīng)期、增長(zhǎng)期和平緩期，發(fā)酵第5～10天為適應(yīng)期，該時(shí)期酶類(lèi)物質(zhì)及微生物代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸較少;發(fā)酵第15～60天為增長(zhǎng)期，此階段有機(jī)酸含量顯著上升，微生物生長(zhǎng)繁殖旺盛，產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，包括豐富的有機(jī)酸，發(fā)酵第70～90天為平穩(wěn)期，有機(jī)酸含量趨于穩(wěn)定且含量較高。草莓酵素有機(jī)酸發(fā)酵初期，糖類(lèi)物質(zhì)消耗較少，發(fā)酵液中的總酸變化不顯著，發(fā)酵中期發(fā)酵液的總酸濃度快速上升，總糖含量隨之快速下降，乳酸和醋酸等有機(jī)酸含量增多，發(fā)酵后期總糖和有機(jī)酸含量趨于穩(wěn)定[35]。這可能是發(fā)酵初期微生物菌群在此階段主要是適應(yīng)環(huán)境，繁殖及代謝活動(dòng)緩慢，產(chǎn)生的有機(jī)酸也較少；發(fā)酵中期，由于植物原料的降解，發(fā)酵液中的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，產(chǎn)酸微生物大量繁殖并代謝產(chǎn)酸；發(fā)酵后期，由于較低pH抑制了微生物的生理活動(dòng)，加上糖類(lèi)物質(zhì)消耗導(dǎo)致總量不斷減少，微生物利用發(fā)酵液中有機(jī)酸作為碳源進(jìn)行一系列代謝活動(dòng)，另一方面可能與有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生的酯類(lèi)等風(fēng)味物質(zhì)有關(guān)，導(dǎo)致有機(jī)酸含量在后期趨于穩(wěn)定或略有下降[36-37]。綜上，明確有機(jī)酸的組成及其變化規(guī)律，進(jìn)而開(kāi)展對(duì)酵素中有機(jī)酸性質(zhì)與特定生理活性的研究，有目的性地調(diào)節(jié)有機(jī)酸種類(lèi)和含量，進(jìn)而對(duì)酵素產(chǎn)品質(zhì)量控制及酵素有機(jī)酸調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能進(jìn)行綜合性評(píng)價(jià)提供理論基礎(chǔ)。

2.3 食用植物酵素中有機(jī)酸的生理活性

2.3.1 抗氧化 方晟等[29]研究表明，金佛手酵素發(fā)酵過(guò)程中DPPH自由基清除率與琥珀酸呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)為0.786；超氧自由基清除率與乳酸含量具有顯著正相關(guān)(P<0.05)；羥基自由基清除率與乳酸和乙酸含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與草酸和L-酒石酸含量為顯著正相關(guān)(P<0.05)，說(shuō)明金佛手酵素中有機(jī)酸具有一定的抗氧化作用，且與有機(jī)酸含量密切相關(guān)。此外，蔣增良等[38]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄酵素的還原力、DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力、超氧自由基清除能力和ABTS自由基清除能力均與有機(jī)酸濃度相關(guān)，葡萄酵素中有機(jī)酸主要為蘋(píng)果酸、乙酸、酒石酸和檸檬酸[39]，微生物發(fā)酵代謝過(guò)程中積累了新的有機(jī)酸，如乙酸、丙酮酸、富馬酸和莽草酸，其良好的自由基清除能力，可能來(lái)自于有機(jī)酸與多種物質(zhì)協(xié)同作用。綜上，發(fā)酵可以顯著提高酵素抗氧化能力，其中乳酸、乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸等有機(jī)酸抗氧化作用顯著。

2.3.2 調(diào)整腸道菌群 食用植物酵素中的益生菌如乳酸菌，一方面可以粘附在腸道上皮，從而阻止大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、梭狀芽孢桿菌等致病菌向腸道上皮內(nèi)的入侵，另一方面益生菌產(chǎn)生的有機(jī)酸，如乳酸和短鏈揮發(fā)性脂肪酸，可以為潛在致病性微生物創(chuàng)造限制性的生理環(huán)境，如降低pH值，從而達(dá)到調(diào)整腸道菌群的效果[6]。有機(jī)酸調(diào)整腸道菌群主要是在腸道發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，包括糖基化、羥基化和甲基化，酵素中有機(jī)酸對(duì)風(fēng)味有重要作用外，還可以被腸道黏膜吸收利用，為腸黏膜代謝提供能源，促進(jìn)黏膜生長(zhǎng)、腸道細(xì)胞增殖和鈉離子吸收等作用，調(diào)整腸道菌群，以此降低腸道及慢性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[40]。因此，食用植物酵素中所含有機(jī)酸有助于調(diào)整腸道菌群。

2.3.3 增強(qiáng)飽腹感，預(yù)防肥胖 食用植物酵素中有機(jī)酸如丙酸、丁酸和乙酸，在飽腹感級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮作用，而以上短鏈脂肪酸主要通過(guò)控制腸道激素(如肽PYY和胰高血糖素樣肽)的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)食物的攝入，丙酸通過(guò)延遲胃排空率和降低血糖和胰島素反應(yīng)使人產(chǎn)生飽腹感，丁酸、丙酸和乙酸鹽均能防止飲食引起的肥胖和胰島素抵抗，可誘導(dǎo)腸道激素和減少食物攝入量[41-43]。對(duì)嗜酸乳桿菌和弗氏丙酸桿菌發(fā)酵飲料的飽腹效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，食用富含丙酸的發(fā)酵飲料明顯增加了飽腹感，同時(shí)通過(guò)視覺(jué)模擬反應(yīng)評(píng)估發(fā)現(xiàn)其饑餓感降低[44]。有機(jī)酸中的短鏈脂肪酸通常是通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生[45]，故可利用益生菌發(fā)酵產(chǎn)生丙酸、乙酸和/或丁酸來(lái)作為生產(chǎn)引起飽腹感的酵素食品，可增強(qiáng)飽腹感并預(yù)防由飲食誘導(dǎo)的肥胖。

2.3.4 抗腫瘤 丁酸有抑制HCT-116細(xì)胞增殖的作用，丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液以劑量—效應(yīng)依賴(lài)性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且凋亡誘導(dǎo)作用與增殖抑制作用強(qiáng)弱順序一致，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物能誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞凋亡，DNA發(fā)生片段化，說(shuō)明發(fā)酵產(chǎn)物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其抑制細(xì)胞增殖的重要途徑；凋亡誘導(dǎo)作用與增殖抑制作用強(qiáng)弱順序也一致，說(shuō)明發(fā)酵產(chǎn)物中的丁酸含量直接影響發(fā)酵產(chǎn)物的抗癌作用[46]，其作用機(jī)制可能是營(yíng)養(yǎng)腸黏膜、恢復(fù)細(xì)胞生理增殖模式和增強(qiáng)谷氨酰胺酶活性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[47]。故酵素中含有的短鏈脂肪酸，如γ-氨基丁酸具有抗腫瘤作用，這為開(kāi)發(fā)預(yù)防結(jié)腸癌作用的酵素功能性食品提供了理論依據(jù)。

2.3.5 抑菌抗炎 酵素食品中富含有機(jī)酸，而有機(jī)酸對(duì)腸道pH調(diào)節(jié)有重要作用，如李寧等[48]研究發(fā)現(xiàn)，微生物酵素有預(yù)防術(shù)后早期感染作用，使環(huán)境pH下降呈酸性，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，并對(duì)病原菌有拮抗作用，能提高消化道局部免疫抗菌功能，同時(shí)可使全身其他黏膜組織產(chǎn)生特異性免疫效應(yīng)，共同達(dá)到抑制致病菌感染的功效。Lamia等[49]研究發(fā)現(xiàn)，由葡萄汁與紅茶共發(fā)酵所形成的酵素液，其發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的乙酸及其他代謝產(chǎn)物，對(duì)細(xì)菌有抑制作用，能夠起到抑菌抗炎效果。綜上，酵素食品中有機(jī)酸的抗菌抗炎作用主要是在控制腸道管腔pH中發(fā)揮作用，從而影響其對(duì)低pH敏感的細(xì)菌(包括部分病原體)的水平[50]。

2.3.6 其他作用 除以上功能外，有機(jī)酸還可能具有降低心腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)、降血脂等其他作用。有研究[51]表明，乳酸菌產(chǎn)生短鏈脂肪酸，主要是乙酸、丙酸和丁酸，作為最終產(chǎn)品短鏈脂肪酸可能會(huì)降低患胃腸道疾病和心血管疾病的患病率。梁艷花[52]研究發(fā)現(xiàn)，紅棗乳酸飲料較紅棗汁有明顯降血脂功能，其中有機(jī)酸、多酚物質(zhì)和其他發(fā)酵產(chǎn)物可能有協(xié)助降血脂的效果。

3 結(jié)論與展望

發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間的微生物群落、代謝物的變化規(guī)律與酵素的品質(zhì)、功能和安全性密切相關(guān)，其中有機(jī)酸的監(jiān)測(cè)可在一定程度上反映微生物對(duì)底物的利用程度，預(yù)測(cè)發(fā)酵完成時(shí)間，也可以作為區(qū)分是否有異常發(fā)酵的重要指標(biāo)之一[53]。中國(guó)對(duì)酵素產(chǎn)品中有機(jī)酸的評(píng)價(jià)體系研究甚少，其中有機(jī)酸調(diào)節(jié)腸道菌群能力評(píng)價(jià)體系的評(píng)價(jià)指標(biāo)單一，且缺乏科學(xué)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，后續(xù)可進(jìn)一步對(duì)酵素中有機(jī)酸的作用機(jī)制進(jìn)行研究，并提出有機(jī)酸的綜合評(píng)價(jià)體系。微生物在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸種類(lèi)和含量不僅對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)和風(fēng)味有重要影響，還會(huì)影響酵素特定生理活性的發(fā)揮，如何準(zhǔn)確調(diào)控發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的含量和種類(lèi)是目前待解決的難題之一。