張 弛，呂雨澤，鄧利廷，孫 健，葛菁萍

（1黑龍江大學農(nóng)業(yè)微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2微生物黑龍江省高校重點實驗室/黑龍江大學生命科學學院，哈爾濱 150080）

0 引言

2,3-丁二醇(2,3-BD)是一種應用化合物，被作為一種重要的化工原料，并且2,3-BD被航天、能源以及食品等多個領域廣泛應用[1]。通常人們利用微生物以石油為底物的方式進行生產(chǎn)2,3-BD被廣受歡迎，然而，現(xiàn)如今2,3-BD的生產(chǎn)含有不足之處：一是產(chǎn)量較低，二是2,3-BD的結構十分特殊，利用化學法合成2,3-BD的成本很高，所以不能用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)[2]。近年來利用生物法來生產(chǎn)2,3-BD等產(chǎn)品受到人們的關注，同時在國內(nèi)外其研究與發(fā)展速度飛快[3]，優(yōu)勢在于其成本低廉，工藝技術簡單，同時具有降低污染，保護環(huán)境的作用[4-5]。

在大自然中，有許多常見的菌種可以用來生產(chǎn)2,3-BD，包括克雷伯氏菌屬(Klebisellasp.)[6-7]、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)[8-9]以及酵母菌屬(Saccharomycessp.)[10]等。不幸的是，克雷伯氏菌屬和芽孢桿菌屬等被歸類為II類致病微生物，容易造成具有危害性的工業(yè)生產(chǎn)[11-12]。相比之下，釀酒酵母已經(jīng)被作為安全性較高的微生物，且具有2,3-BD生產(chǎn)能力[13-14]。這使得研究學者們將釀酒酵母作為生產(chǎn)2,3-BD的焦點。

但是，野生型釀酒酵母本身產(chǎn)生2,3-BD的能力有限，如果不加以人為干涉的話，還不具備進行大規(guī)模生產(chǎn)的潛力。因此人們從改造釀酒酵母代謝途徑的角度出發(fā)，試圖通過阻斷其支路代謝途徑[15]、過表達關鍵酶基因的方式[16]，來提高2,3-BD的產(chǎn)量。在釀酒酵母細胞中，2,3-BD的合成途徑其一是通過丙酮酸在丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase/PDC)的作用下生成乙醛，乙醛在PDC催化下生成乙偶姻，最終乙偶姻在2,3-丁二醇脫氫酶(2,3-butanediol dehydrogenase/BDH)作用下生成2,3-BD。所以，乙偶姻成為2,3-BD合成途徑中重要的前體物質(zhì)[17-18]。本課題組前期已經(jīng)嘗試對丙酮酸脫羧酶1和丙酮酸脫羧酶5基因進行了敲除，導致2,3-BD的產(chǎn)量明顯提升。那么，外源添加適當濃度的物質(zhì)乙偶姻后，是否會繼續(xù)提高2,3-BD的產(chǎn)量以及菌株的生長？本研究將利用上述的兩種突變株以及S.cerevisiaeW5和S.cerevisiaeW141原始菌株對此問題進行探究。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

1.1.1 試驗菌株S.cerevisiaeW5和S.cerevisiaeW141，由黑龍江大學微生物重點實驗室保藏。S.cerevisiaeW5-Δpdc1/Δpdc5，經(jīng)過前期構建，其中W5-Δpdc1和W5-Δpdc5分別是敲除了丙酮酸脫羧酶1和丙酮酸脫羧酶5的基因工程菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基 YPD液體培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，pH自然，108°C高壓滅菌20 min；葡萄糖單碳源發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖80 g/L，YNB 3.4 g/L，蛋白胨 20 g/L，K2HPO43 g/L，KH2PO411.8 g/L，(NH4)2SO410 g/L，pH自然，108°C高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1OD值與細胞干重二者關系確定 將培養(yǎng)至對數(shù)期的4株菌株，接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，30°C，140 r/min，在600 nm處吸光度下，測定吸光值。根據(jù)吸光值，進行梯度稀釋，將菌液稀釋成6個不同的濃度，進行離心后，棄上清，加入適量無菌水，在再行離心處理，將樣品放入烘箱中烘干稱重。

1.2.2 乙偶姻最適添加量的確定 將培養(yǎng)至對數(shù)期的S.cerevisiaeW5/W5-Δpdc1/W5-Δpdc5/W141菌株，進行接種培養(yǎng)，外源添加0、2、4、6、8、10、12、14 g/L乙偶姻至培養(yǎng)基中培養(yǎng)84 h，30°C，140 r/min，每12 h取樣，測定pH值、細胞干重(Dry Cell Weight，DCW)，利用高效液相色譜法(HPLC)對葡萄糖的消耗量、2,3-丁二醇產(chǎn)量以及乙偶姻剩余量進行檢測，進一步確定添加乙偶姻的最適量。

2 結果與分析

2.1 外源添加乙偶姻方案的確立及候選菌株的確定

通過對S.cerevisiaeW5/W5-Δpdc1/W5-Δpdc5/W141乙偶姻產(chǎn)量和BDH酶活進行檢測（圖1），發(fā)現(xiàn)S.cerevisiaeW5-Δpdc5的乙偶姻積累量和BDH酶活性均明星呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，并且在發(fā)酵60 h時達到最大值，此時的乙偶姻積累量為0.626±0.04 g/L，BDH酶活性為0.0257±0.003 U/mg。然而，原始菌株S.cerevisiaeW5的乙偶姻產(chǎn)量為0.110±0.02 g/L，BDH酶活性為0.0099±0.001 U/mg，同時S.cerevisiaeW5-Δpdc5的乙偶姻產(chǎn)量是野生菌株S.cerevisiaeW141產(chǎn)量(0.282±0.02 g/L)的2.2倍，BDH酶活性兩者一致。另外，研究發(fā)現(xiàn)S.cerevisiaeW5-Δpdc1的乙偶姻積累量呈現(xiàn)先上升后下降再上升的微弱趨勢，在發(fā)酵24 h時積累量最大為0.129±0.01 g/L；BDH酶活性同樣在24 h時達到最大值為0.0122±0.001 U/mg；同原始菌株S.cerevisiaeW5相比，乙偶姻積累量提高了17.3%，BDH酶活提高了23.2%，差異明顯。然而，野生菌株S.cerevisiaeW141的乙偶姻產(chǎn)量和BDH酶活性均高于S.cerevisiaeW5-Δpdc1。綜上所述，從乙偶姻產(chǎn)量和BDH酶活性隨發(fā)酵時間變化的趨勢可以看出，乙偶姻的量直接影響了BDH酶的活性，同時間接影響了2,3-BD的產(chǎn)量，最終研究確定外源添加乙偶姻的方案。

以上數(shù)據(jù)表明：第一，S.cerevisiaeW5-Δpdc1/Δpdc5的2,3-BD產(chǎn)量較比原始菌株S.cerevisiaeW5的都有所提高，并且乙偶姻的積累量也會提高，同時促進了BDH酶的活性；第二，通過對S.cerevisiaeW141和S.cerevisiaeW5-Δpdc1/Δpdc5的比較發(fā)現(xiàn) ，S.cerevisiaeW141自身對乙偶姻的積累和BDH酶活性的作用，都是其作為2,3-BD出發(fā)菌株主要的優(yōu)勢。綜上所述，針對于S.cerevisiaeW5/W141的優(yōu)勢和S.cerevisiaeW5-Δpdc1/Δpdc5的不足之處，研究確定使用S.cerevisiaeW5/W141共同作為本實驗生產(chǎn)2,3-BD的出發(fā)菌株。

圖1 乙偶姻產(chǎn)量和BDH酶活檢測結果

2.2 OD值與細胞干重關系曲線

利用OD600nm值來測定菌體生物量，按照1.2.1的方法。根據(jù)OD600nm值與DCW具體關系分別為公式(1)～(2)，結果證明，S.cerevisiaeW5/W141菌株OD600nm值和細胞干重成正比例關系。

2.3 乙偶姻最適添加量的確定

將菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，外源添加0、2、4、6、8、10 g/L和0、2、4、6、8、10、12、14 g/L乙偶姻，30°C，140 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，每隔12 h取樣，葡萄糖消耗情況（圖2）、2,3-BD產(chǎn)量和乙偶姻剩余量隨發(fā)酵時間的變化情況（圖3）。

由圖2可以看出，外源添加不同濃度的乙偶姻對S.cerevisiaeW141/W5，在代謝過程中，葡萄糖隨著發(fā)酵時間的增加，而逐漸被消耗，則在24 h左右，葡萄糖均基本耗盡。

圖2 S.cerevisiae W5/W141的葡萄糖消耗量隨發(fā)酵時間變化的關系曲線

圖3 S.cerevisiae W5/W141的乙偶姻剩余量和2,3-丁二醇產(chǎn)量隨發(fā)酵時間變化的關系曲線

由圖3可以看出，外源添加不同濃度的乙偶姻對S.cerevisiaeW5/W141來說，2,3-BD的產(chǎn)量隨著乙偶姻添加量的增加而不斷提高。對于S.cerevisiaeW141而言，當外源添加8 g/L乙偶姻時，2,3-BD的產(chǎn)量達到1.56±0.04 g/L(72 h)，乙偶姻在72 h時消耗完全；當外源添加10 g/L乙偶姻時，2,3-BD的產(chǎn)量達到2.17±0.01 g/L(72 h)，但乙偶姻并沒有完全被消耗，72 h時積累了1.07±0.01 g/L。對于S.cerevisiaeW5而言，當外源添加12 g/L乙偶姻時，2,3-BD的產(chǎn)量達到2.49±0.02 g/L(72 h)；當外源添加14 g/L乙偶姻時，2,3-BD的產(chǎn)量達到2.75±0.03 g/L(72 h)，但乙偶姻仍然沒有完全被消耗，72 h時積累了2.55±0.04 g/L。因此，從乙偶姻積累量上考慮，向S.cerevisiaeW5/W141分別添加12 g/L和8 g/L乙偶姻更適合作為后續(xù)試驗的最適添加濃度。

2.4 乙偶姻對菌體活性的影響，通過菌體活性輔助說明代謝流向改變的菌體作用

2.4.1S.cerevisiaeW141外源添加8 g/L乙偶姻對的菌體活性的影響 運用細胞活性染色試劑PI對S.cerevisiaeW141/W141-8 g/L菌體進行單染色。將不同時間段的熒光效果利用流式細胞儀對其檢測，F(xiàn)CM圖譜進行熒光差異比較（圖4）。通過對橫坐標（PI單染色）與縱坐標（側向角散射）的對比來對菌體活性情況進行分析（圖5）。

從圖中可知，隨著發(fā)酵時間的延長PI染色比例有所提高，并且所有數(shù)據(jù)都相對集中，S.cerevisiaeW141/W141-8 g/L的變化趨勢大致相同，均在60 h時達到最大分別為1.3%和1.9%，然而，對于流式細胞儀每次所收集的一萬個細胞而言，整體細胞活性幾乎沒有受到影響。

2.4.2S.cerevisiaeW5外源添加12 g/L乙偶姻對的菌體活性的影響 運用細胞活性染色試劑PI對S.cerevisiaeW5/W5-12 g/L菌體進行單染色。將不同時間段的熒光效果利用流式細胞儀對其檢測，F(xiàn)CM圖譜進行熒光差異比較（圖6）。通過對比從而分析菌體活性情況（圖7）。

圖4 不同時間段流式細胞術檢測結果

圖5 流式細胞術檢測結果

從圖中可知，隨著發(fā)酵時間的延長PI染色比例呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，所有數(shù)據(jù)都不太集中，與S.cerevisiaeW141/W141-8 g/L的變化趨勢大致相同，均在24 h時達到最大分為0.6%和0.9%。

2.5 電鏡觀察菌體形態(tài)

將處理后的樣品通過掃描電鏡觀察菌體外貌形態(tài)（圖8）。可以看出，當S.cerevisiaeW141/W5在外源添加適量乙偶姻后，菌體表面圓滑平整，整體飽滿，無明顯變化。

3 結論與討論

本研究前期通過嘗試對丙酮酸脫羧酶的基因pdc1和pdc5進行敲除，在外源添加乙偶姻后，最終導致2,3-BD的產(chǎn)量不高。Yu等[19]敲除S.cerevisiae中的adh1、adh3和adh5基因后進行分批發(fā)酵，2,3-BD的產(chǎn)量達到2.29 g/L，與野生型S.cerevisiae相比，乙醇的產(chǎn)量降低31.25%，而2,3-BD的葡萄糖轉化率顯著提高，為0.113 g/g。但弊端是Δadh1、Δadh3、Δadh5會積累大量的毒性物質(zhì)乙醛，且還會生成一定量的乙醇[20]。而前期試驗結果2,3-BD的產(chǎn)量不高，可能是因為敲除了中心代謝的關鍵酶，所以，當2,3-BD代謝流增強時，菌株產(chǎn)能卻減少了。因為在釀酒酵母中，乙醛和丙酮酸轉化成乙偶姻過程中，丙酮酸脫羧酶在其中起關鍵作用，所以當丙酮酸脫羧酶基因被敲除后，導致關鍵酶的酶活降低，使乙醛和丙酮酸無法更多地轉化成乙偶姻，最終導致菌株產(chǎn)2,3-BD的能力下降[21]。所以在2,3-BD合成過程中，關鍵酶起著至關重要的作用。

圖6 不同時間段流式細胞術檢測結果

圖7 流式細胞術檢測結果

通過釀酒酵母代謝路徑可知，乙醇、甘油和2,3-BD的合成途徑成為酵母菌代謝的三個主要支路[22]。因此，外源添加適當乙偶姻后促使2,3-BD產(chǎn)量增加的同時，必定減少了乙醇或甘油合成過程中的碳源分配，這可能是因為添加適當乙偶姻后，促進了關鍵基因的表達，從而使2,3-BD的產(chǎn)量有所提高，由于乙偶姻和2,3-BD之間的反應是可逆的[23]，所以當2,3-BD產(chǎn)量增加的同時也使丙酮酸到2,3-BD途徑中相關酶的活性增加，所以，碳源在乙醇和甘油合成途徑中減少的情況下，會導致最終的產(chǎn)量下降。同時，乙偶姻和2,3-BD的轉化與NAD＋與NADH之間的轉化具有偶聯(lián)關系[24]。Ehsani等[25]提出了增加供氧的策略，在敲除ilv2基因并過表達als、aldc和bdh1基因的S.cerevisiae中增加溶氧量，甘油積累減少的同時，葡萄糖合成2,3-BD的理論產(chǎn)量比厭氧條件下高20%。這說明通過改變?nèi)苎跽{(diào)節(jié)氧化還原平衡對于生產(chǎn)2,3-BD具有重要意義。Kawai S等[26]將2-丁酮作為外源添加電子受體，使NADH的含量降低，使甘油的產(chǎn)量下降，但2,3-BD的產(chǎn)量明顯提高。Kim S等[27]發(fā)現(xiàn)NADH氧化酶可以將NADH氧化成NAD＋，為了降低NADH的濃度，在過表達als、aldc和bdh1的基因的S.cerevisiae過程菌株中外源表達乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中的NADH氧化酶，從而將甘油代謝流向2,3-BD，最終使2,3-BD的產(chǎn)量提高了23.8%。所以乙偶姻在被BDH催化生成2,3-BD的同時，也會受到NAD＋與NADH含量的影響[28]。

圖8 電鏡觀察結果

本研究將S.cerevisiaeW5/W5-Δpdc1/W5-Δpdc5/W141四株菌株進行試驗對比，挑選出S.cerevisiaeW5/W141最適合作為出發(fā)菌株來生產(chǎn)2,3-BD，發(fā)現(xiàn)S.cerevisiaeW5和S.cerevisiaeW141外源添加乙偶姻的最適濃度為12 g/L和8 g/L，且當S.cerevisiaeW5最適添加量為12 g/L乙偶姻，且72 h時，2,3-BD的產(chǎn)量最大達到2.49±0.02 g/L，并且乙偶姻在發(fā)酵結束前消耗完全；S.cerevisiaeW141最適添加量為8 g/L乙偶姻，且72 h時，2,3-BD的產(chǎn)量最大達到1.56±0.04 g/L。當外源添加適量乙偶姻后，2,3-BD的產(chǎn)量之所以會提高，是因為在整個代謝過程中，乙偶姻與2,3-BD二者處于同一條代謝流中，且乙偶姻作為生產(chǎn)2,3-BD重要的前體物質(zhì)，當乙偶姻的濃度升高時，同時也會伴隨著最終產(chǎn)物的增加[29]。Brackman G等[30]利用異源過表達枯草芽孢桿菌的關鍵基因acoA和acoB，來增強乙醛轉化為乙偶姻的能力，構建菌株進行分批補料發(fā)酵，最終2,3-BD的產(chǎn)量得到提升。Kim S等[31]在S.cerevisiae菌株的基礎上，異源過表達B.subtilis中的alsS和alsD基因和內(nèi)源bdh1基因后進行分批補料發(fā)酵，2,3-BD產(chǎn)量達到了29.1 g/L。理論上講，在抑制乙醇代謝流向并過表達2,3-BD合成途徑后，菌株可以利用葡萄糖經(jīng)丙酮酸、α-乙酰乳酸、乙偶姻合成2,3-BD，或經(jīng)丙酮酸和乙醛轉化成乙偶姻，最終合成2,3-BD。因此，說明在代謝過程中，前體物質(zhì)的增加對產(chǎn)物的產(chǎn)量具有一定促進作用。所以，本研究還可以做進一步的優(yōu)化。通過代謝過程手段使工程菌株具備利用廉價原料（木質(zhì)纖維素和藻類）來合成2,3-BD，從而提高生產(chǎn)2,3-BD的能力，但是，該方法是否會影響菌株正常生長，這些都是今后需要去研究的。綜上所述，本研究中選用S.cerevisiaeW5/W141作為出發(fā)菌株，通過外源添加適量乙偶姻，使2,3-BD產(chǎn)量得到了一定的提升，從而解決了單一釀酒酵母發(fā)酵2,3-BD產(chǎn)量低的問題，也為微生物高產(chǎn)2,3-BD開辟了新的空間。