許萍，趙晨，張麗

(教育部城市雨水與水環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 水環(huán)境國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 北京建筑大學(xué)，北京 100044)

將城市再生水作為工業(yè)冷卻補(bǔ)充水是目前世界各國(guó)解決城市缺水問(wèn)題的主要措施，而其帶來(lái)的微生物腐蝕問(wèn)題也引起了廣泛的關(guān)注[1]。相較于自來(lái)水，再生水含有更多的有機(jī)物以及氮、磷物質(zhì)，更有利于微生物的生長(zhǎng)繁殖。鐵細(xì)菌是造成金屬腐蝕的主要微生物之一。

鐵細(xì)菌包括鐵氧化細(xì)菌(IOB)和鐵還原細(xì)菌(IRB)，其中IOB菌能將二價(jià)鐵氧化成三價(jià)鐵，并從中獲取能量[2]；隨后，F(xiàn)e3+以氫氧化物的形式沉積,并引起各種腐蝕[3-4]。且IOB菌有助于其他微生物在碳鋼表面的定殖[5]。而IRB在厭氧環(huán)境下可以將三價(jià)鐵作為電子受體進(jìn)行厭氧呼吸，從而將三價(jià)鐵還原回二價(jià)鐵。

在國(guó)內(nèi)外研究中發(fā)現(xiàn)，鐵細(xì)菌的種類(lèi)直接影響了其對(duì)金屬腐蝕是促進(jìn)[6-7]還是抑制作用[8-9]，鐵細(xì)菌的數(shù)量直接影響了其作用程度。但現(xiàn)有研究中對(duì)水質(zhì)因素影響鐵細(xì)菌數(shù)量及種群結(jié)構(gòu)的研究較少[10-11]。本研究期望通過(guò)探究再生水中不同底物對(duì)鐵細(xì)菌生長(zhǎng)附著和群落結(jié)構(gòu)的影響，以期對(duì)控制微生物腐蝕提供一些理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

碳酸氫銨、磷酸氫二鉀、氯化鐵、丙酮、無(wú)水乙醇等均為分析純；再生水，取自某城市再生水廠，用超純水稀釋10倍、紫外燈滅菌12 h后備用；鐵細(xì)菌，根據(jù)GBT 14643.6—2009《工業(yè)循環(huán)冷卻水中菌藻的測(cè)定方法 第6部分：鐵細(xì)菌的測(cè)定 MPN法》，在再生水的鐵細(xì)菌檢測(cè)過(guò)程中，收集陽(yáng)性試管，通過(guò)鐵細(xì)菌培養(yǎng)基在同樣條件下富集培養(yǎng)，得到濃度較高的鐵細(xì)菌富集液。

生化培養(yǎng)箱；便攜式溶解氧測(cè)定儀；分光光度計(jì)(具20 mm比色皿)等。

1.2 試片準(zhǔn)備

試片為國(guó)家Ⅰ型標(biāo)準(zhǔn)腐蝕掛片(5 cm×2.5 cm×0.2 cm)，材質(zhì)為20#碳鋼。

試片首先用濾紙清潔，然后用丙酮清潔去除油脂，將其浸入無(wú)水乙醇中，使用脫脂棉擦洗2遍，再移入清潔的無(wú)水乙醇中浸泡片刻，使用脫脂棉擦干，用濾紙包裹于干燥器中干燥24 h備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

選擇氨氮、總磷、總鐵作為研究對(duì)象，每種底物設(shè)置4個(gè)濃度梯度，實(shí)驗(yàn)工況設(shè)置見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)工況設(shè)置Table 1 Setting of test conditions

由表1可知，平行設(shè)置3組共12個(gè)錐形瓶；在每個(gè)錐形瓶中，掛入處理后的碳鋼片，加入1 mL富集好的鐵細(xì)菌，用無(wú)菌膜密封，放入生化培養(yǎng)箱中，在30 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)。

在第0，1，4，8，16 d時(shí)，對(duì)水樣中與碳鋼掛片表面的鐵細(xì)菌數(shù)量、氨氮濃度、總磷濃度以及總鐵濃度進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)水樣中的溶解氧進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)第16 d碳鋼掛片上生物膜群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行DNA測(cè)序。其中，鐵細(xì)菌數(shù)量檢測(cè)方法為MPN計(jì)數(shù)法(GB/T 14643.6)，氨氮、總磷、總鐵的分析方法分別為納氏試劑光度法(HJ 535—2009)、鉬酸銨分光光度法(BG 76002—90)和鄰菲羅啉法(GB/T 8570.7)，溶解氧采用便攜式溶解氧測(cè)定儀檢測(cè)，DNA測(cè)序具體方法是使用 16 s 通用引物對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收16 s片段，連接PMD-19T載體，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行單向測(cè)序。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨氮對(duì)鐵細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

不同氨氮初始濃度下，水溶液中懸浮鐵細(xì)菌與碳鋼掛片上附著鐵細(xì)菌數(shù)量隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖1。

圖1 不同初始氨氮濃度下鐵細(xì)菌數(shù)量的變化Fig.1 Changes in the amount of iron bacteria under different initial ammonia nitrogen concentrations

由圖1可知，在初始濃度為0.4,0.8,1.2 mg/L的工況中，再生水中懸浮態(tài)鐵細(xì)菌的數(shù)量基本上都在第1 d就達(dá)到了峰值，其中0.8 mg/L工況下最高，為925 CFU/L，是0.4 mg/L工況的2.9倍，也比1.2 mg/L工況高出125 CFU/L。說(shuō)明當(dāng)濃度在0.8 mg/L及以下時(shí)，氨氮是再生水中懸浮態(tài)鐵細(xì)菌生長(zhǎng)的限制性底物，增加氨氮濃度，會(huì)加速懸浮態(tài)鐵細(xì)菌的繁殖；但當(dāng)濃度超過(guò)0.8 mg/L以后，鐵細(xì)菌的生長(zhǎng)已不再受氨氮濃度的限制，此時(shí)隨著氨氮濃度的增加，鐵細(xì)菌的數(shù)量不再增加，甚至出現(xiàn)了略有下降的情況。

附著態(tài)鐵細(xì)菌數(shù)量變化規(guī)律與懸浮態(tài)類(lèi)似，也是在0.8 mg/L工況時(shí)出現(xiàn)了最高峰值，但是峰值在第4 d才出現(xiàn)，時(shí)間明顯滯后。掛片上的氨氮主要來(lái)自于水溶液，而氨氮在掛片上的附著積累需要一定的時(shí)間，因此導(dǎo)致了附著態(tài)鐵細(xì)菌出現(xiàn)增長(zhǎng)滯后現(xiàn)象。圖2中掛片上氨氮濃度隨時(shí)間的積累規(guī)律也證明了這一點(diǎn)。

圖2 不同初始濃度下氨氮濃度的變化Fig.2 Changes in ammonia nitrogen concentration under different initial ammonia nitrogen concentrations

由圖2可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，再生水中的氨氮濃度持續(xù)下降，但碳鋼掛片上的氨氮濃度卻不斷增加；到第8 d時(shí)，出現(xiàn)了掛片上的氨氮濃度高于溶液中的現(xiàn)象；至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，掛片上的氨氮濃度已分別是溶液中的2～12倍。這說(shuō)明碳鋼掛片上的生物膜與腐蝕產(chǎn)物層對(duì)氨氮具有明顯的富集作用。靳軍濤[12]的研究發(fā)現(xiàn)，腐蝕瘤內(nèi)的離子濃度比溶液中的濃度高8倍以上，與本研究結(jié)論類(lèi)似。

由圖1可知，無(wú)論是懸浮態(tài)還是附著態(tài)，鐵細(xì)菌數(shù)量在達(dá)到峰值后均出現(xiàn)了快速降低的現(xiàn)象，初期的下降速率高達(dá)50%～60%，說(shuō)明鐵細(xì)菌出現(xiàn)了大量死亡的現(xiàn)象。結(jié)合圖2，0.8 mg/L工況下第4 d時(shí)水中的氨氮濃度為0.452 mg/L，比第1 d時(shí)降低了40%，此時(shí)氨氮濃度已成為制約鐵細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的限制因素，這是導(dǎo)致水中懸浮態(tài)鐵細(xì)菌數(shù)量下降的主要原因。但是與水溶液中不同的是，在掛片上附著態(tài)鐵細(xì)菌，在氨氮濃度持續(xù)增加的情況下，仍然出現(xiàn)了急劇下降的情況，說(shuō)明有其他限制因素造成了附著態(tài)鐵細(xì)菌的死亡。進(jìn)一步測(cè)試水中溶解氧濃度發(fā)現(xiàn)，0.8 mg/L的工況下，第4 d時(shí)，水中的溶解氧已由7.555 mg/L降低至0.572 mg/L，考慮到掛片上生物膜、腐蝕產(chǎn)物層的影響，掛片上的溶解氧濃度更低。Lv等[13]研究發(fā)現(xiàn)，鐵氧化菌的存在會(huì)消耗溶解氧。這也說(shuō)明，如果掛片上主要是鐵氧化細(xì)菌，則溶解氧濃度的大幅降低將會(huì)制約鐵氧化菌的生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致死亡。

2.2 總磷對(duì)鐵細(xì)菌生長(zhǎng)的影響分析

不同總磷初始濃度下，水溶液中懸浮鐵細(xì)菌與碳鋼掛片上附著鐵細(xì)菌數(shù)量隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖3。

圖3 不同初始總磷濃度下鐵細(xì)菌數(shù)量的變化Fig.3 Changes in the amount of iron bacteria under different initial phosphorus concentrations

由圖3可知，加入總磷后，各工況再生水中的懸浮態(tài)鐵細(xì)菌數(shù)量均迅速攀升，均在第1 d就達(dá)到了峰值；但是峰值高低與總磷濃度成反比，在0.5 mg/L 時(shí)最高，為1 000 CFU/L，當(dāng)總磷濃度提升3倍達(dá)到1.5 mg/L時(shí)，懸浮態(tài)鐵細(xì)菌的數(shù)量卻下降了65%；當(dāng)總磷濃度提升15倍，達(dá)到7.5 mg/L時(shí)，懸浮態(tài)鐵細(xì)菌數(shù)量雖然較1.5 mg/L時(shí)略有上升，但仍比0.5 mg/L工況下低了50%。說(shuō)明當(dāng)濃度為0.5 mg/L或更低時(shí)，總磷是再生水中懸浮態(tài)鐵細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的限制性底物；但當(dāng)濃度高于0.5 mg/L后，則會(huì)抑制懸浮態(tài)鐵細(xì)菌的增長(zhǎng)，這跟再生水中磷的遷移轉(zhuǎn)化過(guò)程有關(guān)。

圖4 不同初始濃度下總磷濃度的變化Fig.4 Changes in phosphorus concentration under different initial phosphorus concentrations

由圖4可知，各種工況下，水溶液中的總磷均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)快速降低，其中第1 d下降最快，除了7.5 mg/L工況為63%外，其他工況的下降率均達(dá)80%以上。對(duì)比圖2可知，氨氮工況同期的下降率僅為5%～20%。再生水中的磷，除了少量被掛片吸收富集外，一部分作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被鐵細(xì)菌吸收利用，另一部分以磷酸鹽的形式與二價(jià)、三價(jià)鐵離子反應(yīng)，生成難溶的磷酸鹽沉淀[14]。由圖4可知，0.5 mg/L工況第8 d時(shí)，再生水中的總磷濃度已不足0.01 mg/L，但結(jié)合圖3，此時(shí)懸浮態(tài)鐵細(xì)菌數(shù)量仍然有583 CFU/L，說(shuō)明較低的總磷濃度即可以滿(mǎn)足鐵細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的需要，因此再生水中總磷濃度的快速降低主要是化學(xué)反應(yīng)所致。隨著水溶液中總磷濃度的提高，磷酸鹽沉淀生成速度加快，一方面會(huì)大量消耗水中的鐵離子，使懸浮態(tài)鐵氧化細(xì)菌不能獲得充足的金屬基質(zhì)而死亡[15]；另一方面，磷酸鹽沉淀結(jié)構(gòu)致密[16]，也會(huì)阻礙掛片上溶解氧的傳遞，減緩鐵離子的溶出，從而對(duì)附著態(tài)鐵細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量產(chǎn)生影響。

由圖4可知，總磷工況中附著態(tài)鐵細(xì)菌數(shù)量的最高峰值，跟氨氮工況一樣，也出現(xiàn)在第4 d；但不同的是，隨著再生水中總磷濃度的增加，附著態(tài)鐵細(xì)菌的數(shù)量持續(xù)增多，并沒(méi)有出現(xiàn)下降的現(xiàn)象，其中7.5 mg/L工況下的附著態(tài)鐵細(xì)菌數(shù)量，在峰值時(shí)比其他工況高出了1.7～4.5倍。由圖4可知，水溶液中總磷濃度越高，在掛片上累積的總磷濃度也越高，7.5 mg/L工況第4 d時(shí)的掛片上總磷濃度為0.055 mg/L，是其他工況的5～6.9倍，這是導(dǎo)致其附著態(tài)鐵細(xì)菌數(shù)量最多的主要原因。

對(duì)比圖1和圖4掛片上的附著鐵細(xì)菌數(shù)量發(fā)現(xiàn)，總磷7.5 mg/L工況下的鐵細(xì)菌數(shù)量，較氨氮0.8 mg/L工況高出1倍多；同時(shí)，兩工況下的溶解氧測(cè)試結(jié)果表明，總磷7.5 mg/L工況第4 d時(shí)的溶解氧含量為0.3 mg/L，是氨氮0.8 mg/L工況同期數(shù)值的52%；考慮到磷酸鹽沉淀致密性結(jié)構(gòu)對(duì)氧傳質(zhì)過(guò)程的阻礙，總磷工況下掛片內(nèi)的溶解氧濃度將更低。這說(shuō)明總磷工況中附著鐵細(xì)菌的新陳代謝過(guò)程，對(duì)溶解氧的依賴(lài)程度較輕，有可能以鐵還原細(xì)菌為主。

此外，對(duì)比圖2和圖4發(fā)現(xiàn)，水溶液中總磷為7.50 mg/L時(shí)，第4 d時(shí)掛片上的累積濃度為0.05 mg/L，后者是前者的0.7%；而當(dāng)水溶液中氨氮為0.80 mg/L時(shí)，第4 d時(shí)掛片上的累積濃度為0.25 mg/L，后者則是前者的28%；即使到第16 d，掛片上的最高磷濃度也僅為水溶液中的15.4%，遠(yuǎn)低于氨氮工況的53.5%?？紤]本研究中掛片上的底物測(cè)試樣本均取自浸泡腐蝕產(chǎn)物后的上清液，不包含腐蝕產(chǎn)物本身，因此實(shí)質(zhì)上的測(cè)試結(jié)果均為溶解態(tài)物質(zhì)的含量。研究中出現(xiàn)的掛片上總磷含量低的原因，有可能是由于磷主要以不溶態(tài)形式存在而造成的。有研究發(fā)現(xiàn)，腐蝕產(chǎn)物中Fe(OH)2和Fe(OH)3的單核水合物及其進(jìn)一步縮合形成的不同形態(tài)的多核絡(luò)合物，均具有較多的正電荷和較大的比表面積，有利于吸附并沉淀磷[14]；Mohagheghi等也發(fā)現(xiàn)，在低濃度氯化物溶液中，磷酸氫二鉀會(huì)被吸附在腐蝕產(chǎn)物表層，形成以FeHPO4和Fe3(PO4)2為主要形式的磷酸鐵絡(luò)合物[17]。這些研究也從不同側(cè)面證實(shí)了本研究的上述推論。

2．3總鐵對(duì)鐵細(xì)菌生長(zhǎng)的影響分析

不同總鐵初始濃度下，水溶液中懸浮鐵細(xì)菌與碳鋼掛片上附著鐵細(xì)菌數(shù)量隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖5。

圖5 不同初始總鐵濃度下鐵細(xì)菌數(shù)量的變化Fig.5 Changes in the amount of iron bacteria under different initial iron ion concentrations

由圖5可知，加入三氯化鐵后，各工況再生水中的懸浮態(tài)鐵細(xì)菌數(shù)量均迅速攀升，均在第1 d就達(dá)到了峰值；但峰值高低與總鐵濃度成反比，在0.1 mg/L時(shí)最高，為920 CFU/L，當(dāng)總鐵濃度提升90倍達(dá)到9.0 mg/L時(shí)，懸浮態(tài)鐵細(xì)菌峰值數(shù)量最低，比0.1 mg/L工況低了65%。說(shuō)明當(dāng)濃度為0.1 mg/L或更低時(shí)，總鐵是再生水中懸浮態(tài)鐵細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的限制性底物；但當(dāng)濃度高于0.1 mg/L后，則會(huì)抑制懸浮態(tài)鐵細(xì)菌的生長(zhǎng)。溶液中的鐵氧化細(xì)菌是通過(guò)將Fe2+氧化成Fe3+而獲得能量生長(zhǎng)繁殖的，當(dāng)增加三氯化鐵投加量后，水溶液中的Fe3+含量升高，不利于鐵氧化細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。譚向東的研究也發(fā)現(xiàn)，過(guò)多Fe3+不利于鐵細(xì)菌的生長(zhǎng)，與本文結(jié)論一致[18]。

由圖5可知，附著態(tài)鐵細(xì)菌數(shù)量的最高值出現(xiàn)在1.6 mg/L工況下；與氨氮和總磷工況相同的是，各工況下的附著態(tài)鐵細(xì)菌也均在第4 d出現(xiàn)峰值，且其后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，鐵細(xì)菌的數(shù)量也持續(xù)降低。

不同初始濃度下，水溶液中和掛片上總鐵濃度隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖6。

圖6 不同初始濃度下總鐵濃度變化Fig.6 Changes in iron ion concentration under different initial iron ion concentrations

由圖6可知，與氨氮、總磷工況相比，總鐵工況也出現(xiàn)了水溶液中濃度隨時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)下降、掛片上則持續(xù)上升的現(xiàn)象；但與氨氮、總磷工況不同的是，總鐵工況中出現(xiàn)了掛片上底物濃度高于初始投加濃度的現(xiàn)象；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，0.1,0.8,1.6 mg/L工況下，掛片上的總鐵濃度分別是溶液中初始濃度的14,2,1.6倍。究其原因，掛片上的氨氮、總磷，主要來(lái)自于生物膜、鐵氧化物及其水合物對(duì)溶液中底物的吸收；掛片上的總鐵，除了上述作用外，還含有因基體腐蝕而溶出的鐵，這些鐵一部分轉(zhuǎn)化成腐蝕產(chǎn)物附著在掛片上，另一部分則在腐蝕產(chǎn)物、生物膜的阻隔作用下，在掛片上形成了鐵離子溶液層[12]。

2.4 鐵細(xì)菌生物膜群落結(jié)構(gòu)研究

氨氮、總磷、總鐵工況下，掛片上鐵細(xì)菌的DNA測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，在檢出的微生物中，氨氮工況下鐵細(xì)菌的比例最高，為83.67%，高于總磷工況的62.20%，總鐵工況的65.93%。說(shuō)明3種底物中，氨氮更有利于促進(jìn)再生水中鐵細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖；而總磷、總鐵的加入，在促進(jìn)鐵細(xì)菌生長(zhǎng)的同時(shí)，也在一定程度上促進(jìn)了其他微生物的生長(zhǎng)。

表2 不同工況下掛片上鐵細(xì)菌的DNA測(cè)序結(jié)果Table 2 DNA sequencing results of iron bacteria on the slide under different working conditions

對(duì)比3種工況下的菌屬發(fā)現(xiàn)，氨氮工況的鐵細(xì)菌分屬于5個(gè)菌屬，其中4個(gè)是IOB菌屬，且其菌數(shù)占比高達(dá)75.51%，占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明氨氮工況非常適宜IOB的生長(zhǎng)，也證實(shí)了2.1節(jié)中關(guān)于溶解氧消耗殆盡是導(dǎo)致掛片上附著態(tài)鐵細(xì)菌數(shù)量快速下降原因的推論。

總磷工況的鐵細(xì)菌，分屬于7個(gè)菌屬，與氨氮工況相比，菌屬種類(lèi)更為多樣；其中有3個(gè)是IRB菌屬，菌數(shù)占比為50.95%；另外4個(gè)是IOB菌，菌數(shù)占比僅為11.25%；說(shuō)明總磷工況更適宜于IRB菌的生長(zhǎng)。IRB為厭氧自養(yǎng)菌，可以在近乎厭氧的環(huán)境下生長(zhǎng)，這與2.2節(jié)中的研究結(jié)論一致；同時(shí)，該結(jié)果也從另一個(gè)側(cè)面解釋了磷具有的緩蝕作用。

總鐵工況下的鐵細(xì)菌也分屬于7個(gè)菌屬，其中2個(gè)是IRB菌屬，5個(gè)是IOB菌屬；IOB、IRB的菌數(shù)占比分別為38.22%和27.71%，與氨氮和總磷工況相比，兩者的比例較為接近，說(shuō)明該工況均可有效支持這兩種菌的生長(zhǎng)繁殖。

在3種工況下均檢出了鞘脂單胞菌屬和沉積物桿狀菌屬；其中，鞘脂單胞菌屬為IRB菌，在氨氮工況中菌數(shù)占比為8.16%，遠(yuǎn)低于總磷工況的24.53%、總鐵工況的23.40%；沉積物桿狀菌屬在 3種 工況下的菌數(shù)比則較為接近，分別是4.08%，3.77%，4.28%。鞘脂單胞菌是貧營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中常見(jiàn)的微生物，上述結(jié)果說(shuō)明總磷、總鐵工況比氨氮工況更有利于鞘脂單胞菌屬微生物的生長(zhǎng)。沉積物桿狀菌屬微生物通常位于生物膜的底層，在3種工況下環(huán)境條件類(lèi)似，因此數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定。

3 結(jié)論

(1)氮、磷、鐵3種底物下，各工況的水中懸浮態(tài)鐵細(xì)菌峰值均出現(xiàn)在第1 d，附著態(tài)鐵細(xì)菌峰值均出現(xiàn)在第4 d。當(dāng)水中初始氨氮濃度為0.8 mg/L、總磷濃度為0.5 mg/L、總鐵濃度為0.1 mg/L以及以下時(shí)，氨氮、總磷、總鐵對(duì)于再生水中懸浮態(tài)鐵細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖菌具有明顯的限制作用。

(2)碳鋼掛片對(duì)于3種底物具有顯著的富集作用，掛片上氨氮、總磷、總鐵濃度隨時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，掛片上的氨氮濃度是同期溶液中濃度的2～12倍，總鐵濃度超過(guò)了初始投加濃度，是其1.6～14倍。

(3)3種底物下，掛片上的鐵細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)存在顯著差異。氨氮工況下IOB菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，總磷工況的優(yōu)勢(shì)菌種則是IRB菌；在總鐵工況中，IOB占比略高，但與IRB菌占比間的差異不顯著。