冀渤海，梁靚靚

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院中醫(yī)科,遼寧 沈陽 110004)

膽汁反流性胃炎(Bile reflux gastritis,BRG)，是一種由多種原因引起的胃部黏膜損傷性疾病，常表現(xiàn)為頻繁異常的十二指腸胃反流(Duodenogastric reflux,DGR)[1]。DGR是機體進行自我調節(jié)的一種正常生理反應，幽門括約肌的功能和胃十二指腸動力在很大程度上影響DGR的發(fā)生和反流量的多少[2]。如果幽門括約肌本身存在缺陷，或者受到各種刺激時，會導致其出現(xiàn)功能異常，表現(xiàn)為幽門關閉不全。如果此時胃十二指腸動力也出現(xiàn)異常，具體表現(xiàn)為逆向蠕動增加和胃竇清除能力下降時，便會出現(xiàn)DGR頻繁異常的現(xiàn)象。從十二指腸反流回胃的物質過多并與胃黏膜接觸時間過長，則會對胃黏膜造成損傷。慢性十二指腸胃反流會持續(xù)損傷胃黏膜，最終導致胃黏膜出現(xiàn)各種炎癥、糜爛，甚至惡化為胃潰瘍[3-4]。

在對BRG的臨床治療中，西醫(yī)方法較多但效果并不顯著，而且治療后的病人常呈現(xiàn)較高的復發(fā)率。關于BRG，中醫(yī)的觀點認為其內在原因是脾胃虛弱，其重要發(fā)病機制則是膽氣上逆[5]。中醫(yī)對BRG的治療側重于健脾養(yǎng)胃以及疏肝利膽。作為吾師擬定的經驗方，柴枳夏及湯在治療膽汁反流性胃炎中效果明顯，BRG患者胃痛胃脹、燒心反酸的癥狀有明顯好轉，而且能夠緩解口苦、噯氣的情況。為了對柴枳夏及湯的治療效果進行深入驗證，探究該方在治療BRG時的醫(yī)學原理，本文構建了BRG大鼠模型，對柴枳夏及湯對大鼠胃腸動力的作用進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：Wistar大鼠(SPF級)均為遼寧長生生物技術有限公司繁殖，共50只，均為雄性，體重180～220 g，大鼠的實驗動物生產許可證號：SYXK(遼)2017-0004。大鼠購買后飼養(yǎng)于SPF動物房中，動物房溫度設置為(25±2)℃，溫度、濕度恒定不變，光周期設置為12 h光照/12 h黑暗，大鼠進食飲水不予干預。

1.1.2 藥物及主要試劑：柴枳夏及湯配方，柴胡(批號：18013491)、半夏(批號：18015383)各12 g，炒枳實(批號：18010061)、陳皮(批號：18016601)、雞內金(批號：18023491)各15 g，白芍(批號：18018131)20 g，白及(批號：18012961)、香附(批號：18008831)、干姜(批號：18011161)、炒白術(批號：18014021)各10 g，黃連(批號：18022162)、炙甘草(批號：18004461)各6 g，以上中藥均為配方顆粒劑，北京康人堂藥業(yè)有限公司生產，于中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院藥房購買；達喜片(鋁碳酸鎂片，批號：JS09864)；枸櫞酸莫沙必利分散片(快力片，國藥準字H19990317)；牛黃膽酸鈉、葡聚糖藍2000(北京索萊寶生物科技有限公司)；卵磷脂、胰蛋白酶(上海源葉生物科技有限公司)；大鼠胃動素、血管活性腸肽、生長抑素 ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.1.3 主要儀器：臺式低溫高速離心機(FRESCO 21型，Thermo Scientific Forma)；多功能酶標儀(Synergy H1/H1MFDG型，BioTek)；超聲勻漿機(VCX 130 型，SONICS & MATERIALS INC，USA)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9162型，上海精宏)；電子天平(BSA223S型，Sartorius)以及TUS-200型恒溫金屬浴(上海藍豹試驗設備公司)；TS-100型水平搖床(海門市其林貝爾公司)；HJ-3型磁力攪拌器(上海龍躍儀器設備有限公司)；E100型生物顯微鏡(Nikon公司)；NW30VF型純水機(上?？道追治鰞x器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑配制：反流液配制方法：取蒸餾水100 ml，將卵磷脂250 mg、胰蛋白酶1.5 g和牛膽酸鈉2.5 g溶于其中，不斷攪拌至充分溶解，將反流液灌胃于大鼠。大鼠用柴枳夏及湯配制方法：根據人與大鼠體表面積法換算，按成人柴枳夏及湯用量的6.3倍和12.6倍分別配制柴枳夏及湯低劑量藥液和高劑量藥液，按照生藥量12.77、25.54 g/kg分別灌胃不同處理組大鼠。西藥液配制方法：按照大鼠用藥量達喜片0.27 g/kg，枸櫞酸莫沙比利分散片0.00125 g/kg灌胃給予西藥組大鼠。以上溶液即配即用，溶劑均為蒸餾水。

1.2.2 模型制備：各組大鼠每5天稱重1次。模型組、柴枳夏及湯低、高劑量組及西藥組按照10 ml/kg用量，將反流液灌于大鼠胃中，制造BRG大鼠模型，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃49 d。空白組以蒸餾水灌胃。

1.2.3 實驗分組、給藥及取材：按照大鼠的個體重量，通過隨機數(shù)字表法將50只大鼠隨機分為西藥組、柴枳夏及湯低劑量組、柴枳夏及湯高劑量組以及空白組和模型組五個組。在BRG大鼠模型建立后第8天開始，分別給西藥組和柴枳夏及湯低劑量組及高劑量組大鼠用藥，每天造模6 h后進行藥液灌胃，給藥至第49天。最后一次用藥完畢后，繼續(xù)飼養(yǎng)24 h，期間禁止大鼠進食，不禁止飲水。24 h后，按3 ml/kg用藥量向大鼠腹腔中注射10%水合氯醛使大鼠麻醉，之后開腹并采集腹主動脈血液，收集血清及血漿,10 ml注射器腹主動脈取血每只6 ml，其中3 ml放入抗凝管，室溫放置待血液凝固，凝固20 min后，離心機3500 r/min離心20 min，吸取100 μl上清液，分裝至離心管中后于超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫褂脮r冰浴融化并在2～8 ℃環(huán)境中放置。將大鼠全胃摘下，PBS磷酸鹽緩沖液漂洗鼠胃后用濾紙將血液吸干，之后沿胃大彎側用解剖剪將鼠胃剪開，肉眼觀察胃黏膜。

1.2.4 實驗觀察

1.2.4.1 造模情況觀察：①一般狀態(tài)觀察：觀察空白組及模型組大鼠皮膚毛發(fā)、進食狀態(tài)、興奮程度、睡眠狀態(tài)、大便狀態(tài)和激怒反應等一般狀態(tài)的變化。體毛光滑濃密為優(yōu)，干枯打結無光澤為差；能正常飲食水且每日食量均一為優(yōu)，飲食水困難且每日饑飽不一為差；見人或聽到響動興奮為優(yōu)，反應遲鈍為差；睡眠正常為優(yōu)，易驚醒為差；排正常成型便為優(yōu)，排便稀糊為差；情緒穩(wěn)定為優(yōu)，易激惹為差。用符號表示一般行為狀態(tài)的優(yōu)劣程度，“--”代表程度最差，“-”表示程度較差，“+”表示程度較好，“”表示程度最好。②體重比較：比較空白組及模型組大鼠造模前后體重的變化。③肉眼觀察胃黏膜組織：取材后，肉眼觀察空白組及模型組大鼠胃黏膜表面顏色、光滑程度、有無充血糜爛及有無膽汁和黏液附著。

1.2.4.2 胃腸動力指標觀察：①胃排空率：選取全胃，用剪刀沿著胃大彎剪開，將其中內容物取出，并將內容物溶到4 ml蒸餾水中，后置于離心機中離心10 min，離心機轉速設置為3000 r/min，將離心后的上清液取出，置于酶標儀上測定620 nm處的吸光度值。取另一只裝有4 ml蒸餾水的試管，加入0.4 ml相同濃度的葡聚糖藍2000溶液，同樣在3000 r/min下離心10 min，吸取上清液測量620 nm處的吸光度值，該試管為試驗的標準管。胃排空率的計算公式為：(1-胃內殘留色素吸光度值/標準管色素吸光度值)×100%。②小腸推進率：在完成實驗后，快速將幽門括約肌到結腸末端的全腸放置到用生理鹽水浸泡濕潤的錫箔紙上，輕輕將其剝離開來，在不使用任何外力的情況下將其平鋪于錫箔紙上，然后快速測量小腸幽門括約肌處到葡聚糖藍2000推進前端的距離，此外，還要測量幽門括約肌處至結腸末端的全腸距離。小腸推進率的計算公式為：腸內推進距離(cm)/全腸長度(cm)×100%。

1.2.4.3 大鼠血清及血漿中胃動素(MTL)含量的測定：根據試驗所使用試劑盒的說明書來測定大鼠血清和血漿中的MTL含量，采用ELISA方法進行。簡要步驟：①標準品加樣：設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μl；②加樣：分別設空白孔和待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中加入40 μl樣品稀釋液，然后加入10 μl待測樣品；③加酶：除空白孔外每孔加入酶標試劑100 μl；④溫育：利用封板模將酶標包被板封板后，放置到37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培育1 h；⑤配液：將20倍的濃縮洗滌液稀釋至1倍濃度后備用，稀釋時加入的溶劑為蒸餾水；⑥洗滌：將封板模揭去，倒掉液體并甩干，將洗滌液加滿至每個孔中，靜置反應30 s后倒掉，如此重復5次后拍干；⑦顯色：每孔中先后加入50 μl顯色劑A和50 μl顯色劑B，之后輕輕晃動混勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，避光條件下顯色15 min；⑧終止：每孔中加入50 μl顯色終止劑；⑨測定：用空白孔將儀器調零，按照次序分別測定孔中的OD450nm值。

1.2.4.4 大鼠血清及血漿中血管活性腸肽(VIP)含量的測定：根據試劑盒的說明來測定大鼠血清和血漿中VIP的含量，采用的是ELISA方法。具體步驟同上。

1.2.4.5 大鼠血清及血漿中生長抑素(SS)含量的測定：根據試劑盒的說明來測定大鼠血清和血漿中SS的含量，采用的是ELISA方法。測定方法同上。

2 結 果

2.1 造模情況

2.1.1 一般情況觀察：實驗過程中，空白組大鼠體毛光滑濃密，正常飲食水，體重增長較快，反應靈敏，睡眠正常，排正常成型便，情緒穩(wěn)定。模型組大鼠逐漸出現(xiàn)體毛干枯無光澤，食量減少，消瘦，反應遲鈍，易驚醒，排稀糊便，甚至便中含紅黃色黏液，易激惹。與空白組比較，造模后模型組一般情況明顯變差。

2.1.2 體重比較：見表1?？瞻捉M大鼠體重增長較快，造模后模型組大鼠體重增長速度明顯緩慢，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 空白組與模型組體重變化情況(g)

2.1.3 肉眼觀察胃黏膜組織：空白組大鼠的胃黏膜表面未發(fā)生充血和糜爛狀況，呈現(xiàn)光滑狀態(tài)，顏色呈現(xiàn)淡紅色；模型組大鼠的胃黏膜出現(xiàn)了明顯充血，在胃竇部可看到點狀或片狀糜爛，在胃壁上粘有黃綠色膽汁，同時也有很多泡沫樣黃色黏液，這種情況在胃竇部的發(fā)生更為嚴重。以上結果綜合說明了造模的成功性。

2.2 柴枳夏及湯對膽汁反流性胃炎大鼠胃排空及腸推進的影響 見表2。計算模型組和空白組大鼠的胃排空率及小腸推進率后發(fā)現(xiàn)，模型組的數(shù)據結果均明顯低于空白組(P<0.01)；柴枳夏及湯低劑量組大鼠的胃排空率及小腸推進率亦降低(P<0.05)；柴枳夏及湯高劑量組及西藥組大鼠的胃排空率較空白組有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；柴枳夏及湯高劑量組及西藥組大鼠的小腸推進率與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組比較，柴枳夏及湯低劑量組的胃排空率及小腸推進率有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；柴枳夏及湯高劑量組和西藥組的胃排空率升高顯著(P<0.01)；柴枳夏及湯高劑量組和西藥組的小腸推進率較模型組有所提升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

三組用藥組比較，柴枳夏及湯高劑量組及西藥組大鼠的胃排空率較柴枳夏及湯低劑量組升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；柴枳夏及湯高劑量組及西藥組的小腸推進率較柴枳夏及湯低劑量組亦有所提升，與其相比，柴枳夏及湯高劑量組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，西藥組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；柴枳夏及湯高劑量組大鼠的胃排空率和小腸推進率均優(yōu)于西藥組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠胃排空率、小腸推進率比較(%)

2.3 柴枳夏及湯對膽汁反流性胃炎大鼠胃動素(MTL)的影響 見表3。根據模型組、空白組大鼠的血清及血漿中胃動素含量的測定結果可知，前者模型組的測定結果要明顯低于后者空白組，二者之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；柴枳夏及湯低劑量組的大鼠血清及血漿胃動素含量有所降低(P<0.05)；柴枳夏及湯高劑量組與西藥組大鼠血清及血漿胃動素含量較空白組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

與模型組比較，柴枳夏及湯低劑量組大鼠血清及血漿胃動素含量有所升高(P<0.05)；柴枳夏及湯高劑量組與西藥組大鼠血清及血漿胃動素含量升高顯著(P<0.01)。

三組用藥組比較，柴枳夏及湯高劑量組與西藥組大鼠血清及血漿中胃動素含量均高于柴枳夏及湯低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；柴枳夏及湯高劑量組與西藥組比較，柴枳夏及湯高劑量組大鼠血清及血漿中胃動素含量更高，其中血清差異比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，血漿差異比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 柴枳夏及湯對膽汁反流性胃炎大鼠血管活性腸肽(VIP)的影響 見表4。計算出模型組和空白組大鼠的血清及血漿中VIP含量后發(fā)現(xiàn)，前者模型組的含量比后者空白組高，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；柴枳夏及湯低劑量組的大鼠血清及血漿VIP含量較空白組有所升高(P<0.05)；柴枳夏及湯高劑量組與西藥組大鼠血清及血漿VIP含量較空白組有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

與模型組比較，柴枳夏及湯低劑量組大鼠血清及血漿VIP含量有所降低，但變化不明顯(P>0.05)；柴枳夏及湯高劑量組與西藥組大鼠血清及血漿VIP含量較模型組顯著降低(P<0.01)。

三組用藥組比較，柴枳夏及湯高劑量組與西藥組大鼠血清及血漿中VIP含量均低于柴枳夏及湯低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；柴枳夏及湯高劑量組與西藥組比較，柴枳夏及湯高劑量組大鼠血清及血漿中VIP含量更低，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠胃動素(MTL)含量比較

表5 各組大鼠血管活性腸肽(VIP)含量比較

2.5 柴枳夏及湯對膽汁反流性胃炎大鼠生長抑素(SS)的影響 見表5。與空白組比較，模型組大鼠血清及血漿SS含量均顯著升高，差異明顯(P<0.01)；柴枳夏及湯低劑量組大鼠血清及血漿SS含量較空白組有所升高(P<0.05)；柴枳夏及湯高劑量組大鼠血清及血漿SS含量較空白組無明顯改變(P>0.05)；西藥組大鼠血漿SS含量與空白組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。與模型組比較，柴枳夏及湯低劑量組大鼠血清及血漿SS含量有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；柴枳夏及湯高劑量組大鼠血清及血漿SS含量較模型組顯著降低(P<0.01)；西藥組大鼠血清及血漿SS含量有所降低(P<0.05)。三組用藥組比較，柴枳夏及湯高劑量組與西藥組大鼠血清及血漿中SS含量均低于柴枳夏及湯低劑量組，與其相比，柴枳夏及湯高劑量組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，西藥組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；柴枳夏及湯高劑量組與西藥組比較，柴枳夏及湯高劑量組大鼠血清及血漿中SS含量更低，其中血清的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，血漿的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表5 各組大鼠生長抑素(SS)含量比較

3 討 論

在消化系統(tǒng)發(fā)生的疾病類型中，膽汁反流性胃炎是較為常見的一種，當十二指腸內容物反流到胃部時，如果不能及時得到有效的清除，會造成胃黏膜的損傷，并產生炎性反應[6]。增加膽汁反流發(fā)生的可能性因素較多，主要是胃十二指腸運動功能異常，包括十二指腸逆行蠕動增加、幽門功能下降、胃竇清除能力降低等，這些因素一方面引起十二指腸胃反流，另一方面使胃排空發(fā)生延遲，增加膽汁與胃黏膜的接觸時間，加重胃黏膜損傷[7-9]。

胃腸道的運動有助于消化系統(tǒng)行使其生理功能，并且是消化道生理功能重要的組成部分，在醫(yī)學臨床病例中，因胃腸道運動方面的功能受阻所發(fā)生的疾病很多，膽汁反流性胃炎就在其中，其主要病理生理基礎為胃排空延遲及腸蠕動減緩[10],表現(xiàn)為胃排空率和小腸推進率的下降，增強胃腸動力有助于治療膽汁反流性胃炎。

機體在調節(jié)胃腸動力的過程中，胃腸激素是一種有效的方式。對十二指腸胃反流起促進作用的有生長抑素、血管活性腸肽、促胰液素、神經緊張素等,起抑制作用的主要有胃泌素、胃動素、蛙皮素和P物質[11]。胃動素、血管活性腸肽和生長抑素都是機體中發(fā)揮關鍵作用的胃腸道激素，它們主要在胃腸組織中起作用，通過各部分的相互影響和協(xié)同作用來行使功能，即胃腸道的運動和分泌功能[12]。因此，我們通過檢測膽汁反流性胃炎大鼠血清與血漿中MTL、VIP和SS的含量，觀察柴枳夏及湯對胃腸激素的調節(jié)作用。

MTL是胃腸黏膜中分泌的多肽物質，在啟動胃腸收縮運動中起到關鍵作用，是一種腦腸肽。MTL對平滑肌的肌電活動和胃腸道的自主運動具有興奮作用，有助于增強胃腸道的張力和收縮力，有效加快胃腸運動，促進胃排空的進行，人們稱之為“清道夫”[13]。VIP是腸神經系統(tǒng)中的一類肽能神經遞質，具有抑制作用，會使食管下括約肌松弛，而食管下括約肌的壓力越低，血漿中的VIP含量越高，二者呈負相關關系，VIP神經元的數(shù)量增加或者功能增強后，會使食管下括約肌在行使其運動功能時受到阻礙[14]。SS主要存在于胃腸道黏膜的D細胞中，且含量很高，其中胃體和胃竇部的含量最高，在腸中，位置越靠下，SS的含量越低，SS對于胃腸激素的釋放具有一定的抑制作用，可抑制胃泌素、胃動素、胰高血糖素等的釋放，同時也抑制胃酸、胃蛋白酶、唾液淀粉酶等的分泌。

在中醫(yī)學中，膽汁反流性胃炎屬于“嘔膽”“吐酸”“痞證”“嘈雜”“胃脘痛”的范疇。在近現(xiàn)代醫(yī)學專家對膽汁反流性胃炎的認知中，基本與古代醫(yī)家相同，大部分都認為是“本虛標實”之證，所以應該通過康健脾胃來根治“本”、通過疏肝導滯來治其“標”。

柴枳夏及湯一方中的柴胡具有疏肝主升的功能，能夠條達肝氣并疏郁結，枳實具有理脾主降、下氣破結的功效，兩味藥一升一降可使一身氣機暢通，共為該方中的君藥；半夏能夠降逆止嘔，同時散結除痞，黃連性苦寒能夠泄熱開痞，干姜性辛溫能夠溫中散寒，三味藥一同使用，則寒熱平調、辛開苦降，共同作為本方的臣藥；白芍具有柔肝止痛的功效，能夠養(yǎng)血斂陰，可以使柴胡升散但沒有耗傷陰血之弊端，香附、陳皮在疏肝解郁的同時也可理氣健脾，可共同用為本方佐藥；白及有消腫生肌之功效，雞內金則能消食化積，白術能夠健脾益氣，炙甘草能夠緩急和中，并能實現(xiàn)各味藥的調和，這四味共同作為本方的使藥。諸藥共同使用，既能治標，又能治本，治以疏肝降逆，同時理氣和胃，疏導肝氣，下降胃氣，升降乃復，最終實現(xiàn)膽汁的正常排泄，當氣機調暢之后，所有病癥便會痊愈。

在前期實驗中，已經證實所用造模方法可行并能獲得理想的BRG大鼠模型[15]，故本實驗繼續(xù)沿用。前期實驗證實柴枳夏及湯對BRG大鼠胃黏膜具有保護作用且臨床療效甚佳[15]，故本實驗繼續(xù)利用動物模型探討該方在胃腸動力方面的作用。經研究發(fā)現(xiàn)，柴枳夏及湯能夠提高膽汁反流性胃炎大鼠MTL含量，能夠降低其VIP及SS含量，同時提升胃排空率及小腸推進率，且柴枳夏及湯高劑量組比低劑量組在提升胃動力、加速胃排空、提高小腸推進率、降低SS和VIP含量、提高MTL含量等方面效果更為顯著，即療效與劑量成正比。此外，柴枳夏及湯高劑量組大鼠血漿中的MTL含量高于西藥組，SS含量低于西藥組，說明高劑量的柴枳夏及湯在血漿中對于MTL和SS含量的調節(jié)效果優(yōu)于西藥。

根據以上結果來看，在增強胃腸動力方面，柴枳夏及湯的作用效果顯著，作用機制可能與影響MTL、VIP及SS的水平有關。