楊 園， 谷亦平*， 崔 然

(1.武漢藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，湖北武漢430075；2.武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430072)

拉坦噻嗎滴眼液是拉坦前列素和馬來(lái)酸噻嗎洛爾的復(fù)方制劑，臨床上用于青光眼的治療[1]。青光眼病人眼內(nèi)壓的升高，會(huì)導(dǎo)致眼睛視神經(jīng)受損，是一種不可逆的致盲性眼病。通常眼內(nèi)液(房水)通過(guò)通道從眼內(nèi)流出，如果通道受阻，眼液積聚導(dǎo)致青光眼發(fā)生。拉坦前列素是新型苯基替代的丙基酯前列素F2α，屬于前列腺素類藥物，為選擇性F2α受體激動(dòng)劑，通過(guò)非壓力依賴性房水外流途徑降低眼內(nèi)壓[2,3]；馬來(lái)酸噻嗎洛爾是非選擇性β腎上腺素受體阻滯劑，能抑制房水生成、減少房水流出率降低眼壓[4,5]。與臨床上聯(lián)合使用拉坦前列素滴眼液和馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液相比，拉坦噻嗎滴眼液作為復(fù)方制劑，因其在臨床上每天僅使用一次，每次一滴，而且具有更好的依從性，同時(shí)使用復(fù)方制劑可減少防腐劑對(duì)病人眼表的影響。

目前測(cè)定拉坦前列素[6 - 10]和馬來(lái)酸噻嗎洛爾[11 - 15]的方法較多，但這些測(cè)定方法僅適用于其中單一藥物的分析測(cè)定，不能同時(shí)測(cè)定以上兩種藥物。本文采用Nucleosil C18色譜柱，以乙腈和0.025 mol/L磷酸鹽緩沖溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定拉坦噻嗎滴眼液中拉坦前列素和馬來(lái)酸噻嗎洛爾含量的分析方法。本方法可用于市售拉坦噻嗎滴眼液的含量測(cè)定，為拉坦噻嗎滴眼液的含量測(cè)定提供新的方法和技術(shù)支持，為拉坦噻嗎滴眼液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，對(duì)常用的青光眼類藥物的同時(shí)測(cè)定提供分離條件，為青光眼類藥物的質(zhì)量控制提供新的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Angilent1260高效液相色譜儀(美國(guó)，安捷倫公司)，附二極管陣列檢測(cè)器(1260DAD)；Mettler Toledo XS105天平，Mettler AE-200電子天平(瑞士，梅特勒公司)；Clxxxuvm2純水機(jī)(ELGA公司)；JPCQ1028全數(shù)字超聲波發(fā)生器(武漢嘉鵬電子有限公司)；VD23真空干燥箱(德國(guó)，BINDER公司)；SevenEasy酸度計(jì)(瑞士，梅特勒公司)。

拉坦前列素對(duì)照品(160208-QCOS -3，純度：98.1%)、馬來(lái)酸噻嗎洛爾對(duì)照品(120208-QCOS-6，純度：99.9%)。馬來(lái)酸(化學(xué)純，成都科龍化工試劑廠)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific LOT150941)、NaH2PO4、H3PO4(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

拉坦噻嗎滴眼液(批號(hào)：S89115，S85834，T52454，規(guī)格1 mL：拉坦前列素50 μg與馬來(lái)酸噻嗎洛爾(以噻嗎洛爾計(jì)) 5 mg，2.5 mL/branch)。

1.2 溶液配制

1.2.1 混合對(duì)照品溶液取拉坦前列素和馬來(lái)酸噻嗎洛爾(以噻嗎洛爾計(jì))對(duì)照品適量，精密稱定，置于容量瓶中，加溶劑(流動(dòng)相A)制成每1 mL分別含拉坦前列素和噻嗎洛爾50 μg和5 mg的溶液，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL，置于50 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含拉坦前列素和噻嗎洛爾分別為5 μg和0.5 mg的混合對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液精密吸取拉坦噻嗎滴眼液2 mL，置于20 mL容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

1.3 色譜條件

色譜柱：Nucleosil C18柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.025 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=2.5)(10∶90，V/V)為流動(dòng)相A，乙腈-0.025 mol/L PBS(pH=2.5)(80∶20，V/V)為流動(dòng)相B；梯度洗脫(0～2.0 min，85%A；2.0～2.1 min，85%～41%A；2.1～10.0 min，41%A；10.0～10.1 min，41%～0%A；10.1～17.0 min，0%A；17.0～17.1 min，0%～85%A；17.1～25.0 min，85%A)；流速：0.35 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：200 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

拉坦噻嗎滴眼液的規(guī)格為1 mL：拉坦前列素50 μg與噻嗎洛爾5 mg，滴眼液中噻嗎洛爾的濃度是拉坦前列素濃度的100倍，濃度相差較大，故選擇濃度低的拉坦前列素的最大吸收波長(zhǎng)200 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 色譜柱的選擇

本方法對(duì)Nucleosil C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)和Kromasil C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)進(jìn)行了考察。同一混合對(duì)照品溶液，在流動(dòng)相相同的條件下，二者峰形都比較好，但拉坦前列素在Nucleosil C18色譜柱中出峰快，響應(yīng)高。因此，選用Nucleosil C18色譜柱。

2.3 流動(dòng)相的選擇

參考文獻(xiàn)報(bào)道[7,9 - 15]的色譜條件，實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-磷酸鹽緩沖液和乙腈-磷酸鹽緩沖液的等度洗脫和梯度洗脫，最終確定乙腈-磷酸鹽緩沖液，并優(yōu)化梯度洗脫程序。結(jié)果表明，選用乙腈-磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，拉坦前列素和噻嗎洛爾的保留時(shí)間分別為11 min和3 min，出峰時(shí)間適宜，峰形好，拉坦前列素峰和噻嗎洛爾峰的分離度RS為28。在上述色譜條件下，樣品中其他成分對(duì)拉坦前列素和噻嗎洛爾的測(cè)定無(wú)干擾。對(duì)照品、樣品及溶劑色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品(A)、供試品溶液(B)及空白溶劑(C)高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatograms of mixed standards(A),test solution(B) and blank solvent(C)1.maleate；2.timolol；3.latanoprost.

2.4 線性關(guān)系

按上述建立高效液相色譜法，對(duì)質(zhì)量濃度分別為22.35、11.17、5.59、2.24、1.12 μg/mL的拉坦前列素，以及質(zhì)量濃度分別為1.78、0.89、0.44、0.18、0.089 mg/mL的噻嗎洛爾混合對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。拉坦前列素和噻嗎洛爾的回歸曲線如表1所示。

表1 線性方程和相關(guān)系數(shù)(r2)Table 1 Linear equation and correlation coefficient (r2)

2.5 回收率和精密度試驗(yàn)

精密吸取已知含量的拉坦噻嗎滴眼液5 mL，共9份，分別置于100 mL容量瓶中，分別精密加入拉坦前列素和馬來(lái)酸噻嗎洛爾(以噻嗎洛爾計(jì))對(duì)照品溶液，按照1.2.2項(xiàng)下方法制備80%、100%、120% 3個(gè)水平的供試品溶液，按1.3色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，結(jié)果見表2。拉坦前列素和噻嗎洛爾的平均回收率為98.8%～100.8%、98.4%～100.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于1.0%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度和精密度良好。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Table 2 Results of recovery test(n=9)

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取制備好的供試品溶液(批號(hào):S89115)，室溫放置，按1.3色譜條件，分別于制備后0、2、4、6、8、12、20 h進(jìn)行分析測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果拉坦前列素和噻嗎洛爾峰面積的RSD分別為0.7%和0.9%。表明供試品溶液中拉坦前列素和噻嗎洛爾在室溫放置20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)拉坦噻嗎滴眼液(批號(hào)：S89115)，分別按1.2.2平行制備6份供試品溶液，按1.3色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果樣品中拉坦前列素和噻嗎洛爾的平均含量分別為99.1%、100.6%；RSD分別為0.8%、0.3%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 樣品測(cè)定

精密量取不同批號(hào)的拉坦噻嗎滴眼液各2份，按照1.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按1.3項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中拉坦前列素和噻嗎洛爾的含量，結(jié)果見表3。

表3 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果Table 3 Results of detection in real samples

3 結(jié)論

本文建立高效液相色譜法，同時(shí)測(cè)定拉坦噻嗎滴眼液中拉坦前列素和噻嗎洛爾的含量，該方法靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于拉坦噻嗎滴眼液的含量測(cè)定。