尤偉靜 蔣欣如 凌慶枝

摘 要 野外采集白蟻蟻巢中的黑柄炭角菌菌索，分離純化出黑柄炭角菌菌種，并對該菌的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：葡萄糖、果糖是黑柄炭角菌生長較好的碳源，黃豆粉是良好的氮源;黑柄炭角菌是一種中溫性真菌，最適培養(yǎng)溫度25 ℃，pH值5.5左右為最佳，濕度85%，菌絲滿瓶快、菌絲生長密度和潔白度高，自然光照條件下原基和子座形成早、數(shù)量多、質(zhì)量好。

關(guān)鍵詞 黑柄炭角菌;烏靈參;培育;條件優(yōu)化

中圖分類號：S646 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.32.001

子囊菌綱、炭角菌科的黑柄炭角菌[Xylaria nigripes （KI.） Sacc.，XN]別名烏靈參、雞茯苓、地炭棍，主要產(chǎn)于江蘇省、浙江省、四川省、云南省等地，生長在地下0.5～2.0 m黑翅土棲白蟻遺棄的菌圃腔內(nèi)，是一種傳統(tǒng)的藥用真菌、食用菌，具有豐富的生物活性成分、特殊的生物學(xué)特性及廣泛的藥理作用，被世界藥用真菌、應(yīng)用研究等領(lǐng)域均視為名貴、珍稀藥材。黑柄炭角菌菌粉在臨床上用于鎮(zhèn)靜安神、抗焦慮、抗抑郁，且其效果己經(jīng)得到證實(shí)，并且不良反應(yīng)較少，顯示出其在中醫(yī)藥方面的獨(dú)特優(yōu)勢[1]。

盡管黑柄炭角菌在臨床上的應(yīng)用療效得到了認(rèn)可，但因其生長在地下深處黑翅土棲白蟻廢棄的蟻巢上，生長環(huán)境奇特、采掘困難，使得野外采集的黑柄炭角菌樣品量有限，單一化合物的分離純化和相應(yīng)的藥理學(xué)報(bào)道較少，所以對其的研究及推廣非常緩慢[2]。目前，國內(nèi)僅有黑柄炭角菌發(fā)酵菌絲生產(chǎn)的報(bào)道。作為一個(gè)具有廣闊開發(fā)潛力的藥用真菌，資源短缺是限制其開發(fā)利用的瓶頸，而人工培育藥用真菌是擴(kuò)展其自然資源行之有效的途徑，因此開發(fā)黑柄炭角菌這一珍貴藥用真菌資源，解決野生黑柄炭角菌因自然資源有限、科學(xué)試驗(yàn)和研究難以展開和市場開發(fā)利用受限的實(shí)際問題，對野外采集的黑柄炭角菌進(jìn)行菌株分離與鑒定，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行優(yōu)化研究，旨在為后續(xù)的馴化栽培和進(jìn)一步深入研究及開發(fā)利用等奠定基礎(chǔ)，以期進(jìn)一步擴(kuò)大其藥源[3-4]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種的來源

本研究以在浙江省麗水市山區(qū)采集的野生黑柄炭角菌子實(shí)體為實(shí)驗(yàn)材料，通過組織分離純化得到菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基與主要試劑

1）菌種的分離與保藏培養(yǎng)基（改良PDA）：磷酸氫二鉀0.5 g·L-1、磷酸二氫鉀1 g·L-1、蠶蛹粉5 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、瓊脂20 g·L-1、馬鈴薯200 g·L-1，自然pH值。

2）培養(yǎng)基：葡萄糖10 g·L-1、石膏10 g·L-1、硫酸鎂10 g·L-1、硫酸鋅l0 g·L-1、磷酸二氫鉀10 g·L-1、米糠200 g·L-1、木屑750 g·L-1，自然pH值。

1.2 黑柄炭角菌菌種的分離、純化及鑒定

采用子實(shí)體組織分離法對野生鮮品黑柄炭角菌進(jìn)行菌種分離。將黑柄炭角菌子實(shí)體在嚴(yán)格無菌條件下用無菌水沖洗數(shù)次，再用75%的酒精表面消毒滅菌處理，用刀片將其切取3 mm×3 mm大小的塊狀體，接種于PDA斜面培養(yǎng)基上面，于25 ℃下培養(yǎng)7 d左右，即可獲得菌絲體。將上述分離得到的菌種運(yùn)用PCR擴(kuò)增技術(shù)測定ITS序列，并與Genbank中序列對比證明分離得到的菌種為黑柄炭角菌，人工培育菌絲體及子實(shí)體亦為黑柄炭角菌[3-4]。

1.3 黑柄炭角菌人工栽培及條件優(yōu)化選擇

1.3.1 黑柄炭角菌人工栽培工藝流程

培養(yǎng)基的配制→滅菌→接種→生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)→室內(nèi)培養(yǎng)→子座形成。

1.3.2 黑柄炭角菌人工栽培條件優(yōu)化選擇

培養(yǎng)基常規(guī)滅菌，待溫度降至室溫后，取生長時(shí)間和長勢一致的菌種，用直徑5 mm的打孔器進(jìn)行接種，生化培養(yǎng)箱暗光培養(yǎng)（菌絲生長階段）。菌絲滿瓶取出，去掉封口紙后置于室內(nèi)培養(yǎng)（原基分化及子座生長階段），同時(shí)分別進(jìn)行不同營養(yǎng)條件、pH值、濕度、溫度及光照等因子對其生長影響的實(shí)驗(yàn)，每瓶裝

100 mL，每個(gè)處理10次重復(fù)，每瓶為1次重復(fù)。以菌絲體產(chǎn)量，原基分化時(shí)間、形態(tài)、數(shù)量，子座成熟時(shí)間、形態(tài)、數(shù)量、顏色及生長高度為依據(jù)進(jìn)行比較選擇[3-4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲體的生長與形態(tài)特征

接種后，接種處周圍長出薄薄的一層灰白色的基生菌絲，再經(jīng)過一定時(shí)間后，菌絲幾乎布滿整個(gè)培養(yǎng)基表層，基生菌絲上面長出茂密的一層白色的氣生菌絲，氣生菌絲相互扭結(jié)形成菌索，最后形成子座。

2.2 黑柄炭角菌人工栽培條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 碳源對黑柄炭角菌菌絲體產(chǎn)量的影響

以不加葡萄糖基本培養(yǎng)基為對照，分別加入不同的碳源，接種后25 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱暗箱培養(yǎng)168 h，然后分別過濾、干燥、稱菌絲體重量[4]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：黑柄炭角菌菌絲體生長中碳源以葡萄糖、果糖的利用效果較好，麥芽糖、甘露醇、淀粉的利用效果一般，對蔗糖的利用效果最差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.2.2 氮源對黑柄炭角菌菌絲體產(chǎn)量的影響

在基本培養(yǎng)基中不加黃豆粉為對照，分別加入不同的氮源，接種后25 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱暗箱培養(yǎng)168 h，然后分別過濾、干燥、稱菌絲體重量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：黑柄炭角菌菌絲體生長中氮源以黃豆粉的利用效果較好，蠶蛹粉、蛋白胨、酵母浸膏的利用效果次之，花生粉最差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.2.3 pH值對黑柄炭角菌菌絲體產(chǎn)量的影響

黑柄炭角菌菌絲生長階段，葡萄糖作為碳源、黃豆粉作為氮源添加至培養(yǎng)基，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基自然pH值，分別設(shè)pH值處理：4.0、4.5、5.0、5.3、5.5、5.8、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，接種后25 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱暗箱培養(yǎng)168 h，最后分別過濾、干燥、稱菌絲體重量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：黑柄炭角菌菌絲在pH值為4.5～8.0均能生長，但以5.5左右為最佳，菌絲體直徑較大，生長旺盛、粗壯，干重較重。在pH值低于4.5或者高于8.0時(shí)，前期生長緩慢（72 h之前），中期停止生長開始凋亡（72～96 h），后期甚至死亡（96～168 h）;在pH值為5.0～5.8時(shí)，菌絲前期生長較慢（72 h之前），中后期生長速度加快（72～168 h），可能是菌絲生長過程中分泌的堿性物質(zhì)使培養(yǎng)基的pH朝著合適的條件生長，結(jié)果見表3。

2.2.4 溫度對黑柄炭角菌菌絲體產(chǎn)量及原基分化的影響

黑柄炭角菌菌絲生長階段，葡萄糖作為碳源、黃豆粉作為氮源添加至培養(yǎng)基，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基至自然pH值5.5，分別設(shè)溫度處理：0 ℃、5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，空氣相對濕度保持85%～95%，散射光一致（100 lx）。分別記錄過濾干燥后菌絲體重量及原基形態(tài)、原基分化的數(shù)量、所需天數(shù)[3]。實(shí)驗(yàn)表明：黑柄炭角菌是一種中溫性真菌，在15～35 ℃下均能夠生長和原基分化。從菌絲體產(chǎn)量及原基分化所需天數(shù)、分化數(shù)量考慮，最適合培養(yǎng)的溫度為25 ℃，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

原基數(shù)量：分多（+++）、中（++）、少（+）、無（-）4級;菌絲體、原基、子座形態(tài)：按直徑和長度分粗壯（較長）、粗短、細(xì)弱（短?。⑺ダ?級（以下表格都適用）。

2.2.5 光照對菌絲體生長及黑柄炭角菌原基分化的影響

菌絲生長階段及其他培養(yǎng)條件同2.1.4，黑柄炭角菌原基分化階段分別設(shè)散射光處理：0（黑暗）、100 lx（室內(nèi)自然散射光）、1 000 lx（5 m2的房間4盞60W日光燈），溫度保持25 ℃，記錄菌絲體生長情況，原基形態(tài)、原基分化的數(shù)量、所需天數(shù)[3]。實(shí)驗(yàn)表明：1 000 lx散射光條件下完成原基分化的速度快，但形態(tài)細(xì)弱、數(shù)量少;黑暗條件下有原基分化，但形態(tài)細(xì)弱、色白、數(shù)量少、速度慢。100 lx自然散射光最適合栽培黑柄炭角菌生長，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

2.2.6 濕度對黑柄炭角菌原基分化及子座的影響

菌絲生長階段及其他培養(yǎng)條件同2.1.4，黑柄炭角菌原基分化及子座生長階段分別設(shè)濕度處理：70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%，保持散射光一致（100 lx），保持溫度25 ℃，記錄原基分化的形態(tài)、數(shù)量、所需天數(shù)及子座形態(tài)、數(shù)量及成熟時(shí)間[3]。實(shí)驗(yàn)表明：黑柄炭角菌的子實(shí)體發(fā)育要求高濕度，濕度在85%～100%下均能夠原基分化和子座成熟。從原基分化及子座成熟所需天數(shù)、數(shù)量考慮，最適合濕度為85%～90%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

3 結(jié)論與討論

二十世紀(jì)八九十年代，我國科研人員陳宛如等對黑柄炭角菌的菌種分離、生物學(xué)特性、深層發(fā)酵及功效做了較多的研究，但是近20年來相關(guān)的培養(yǎng)特性和栽培馴化的研究寥寥無幾，這可能與黑柄炭角菌的特殊生境、自然資源稀少、采集與分離困難有關(guān)[4]。因此，需要加快它的研究與開發(fā)利用，為進(jìn)一步擴(kuò)大其藥源奠定基礎(chǔ)。

在人工培育環(huán)境影響因子實(shí)驗(yàn)研究中，通過單因素和正交試驗(yàn)，確定溫度對黑柄炭角菌的生長影響最大，在溫度25 ℃、濕度85%條件下，原基及子座形成早、數(shù)量多、質(zhì)量好，這與其生長的土棲黑翅土白蟻巢中穩(wěn)定的生態(tài)環(huán)境溫度25 ℃左右是相吻合的，并且黑柄炭角菌菌絲體不耐低溫，在5 ℃下即解體死亡，因此菌種切不可放入冰箱內(nèi)，而應(yīng)在13 ℃左右溫度下保存，同時(shí)溫度高于35 ℃時(shí)菌絲體幾乎不萌發(fā)，以上證明黑柄炭角菌屬于中溫型菌類[5-6]。其次是pH值的影響，黑柄炭角菌菌絲最適合的pH值為5.5左右，當(dāng)?shù)陀?.5或者高于8.0時(shí)都生長緩慢至停止生長，并且在黑柄炭角菌生長過程中培養(yǎng)基的pH值有所提高，這說明其在代謝過程中可能分泌某些堿性物質(zhì)。另外，根據(jù)觀察，在黑暗和室內(nèi)通常光照條件下，菌絲均能生長，在明亮條件下的斜面上，菌絲7 d后就形成菌索，15 d后開始衰老;而在全暗條件下菌絲生長密又粗壯，這可能是因?yàn)楹诒拷蔷z適應(yīng)了長期生長在完全沒有光線的黑翅土白蟻菌圃上這一特殊的環(huán)境，因此在保存菌種時(shí)，使菌種處于黑暗條件下較合適，但當(dāng)由菌絲形成菌索和子座時(shí)，則產(chǎn)生明顯的向光生長，這也是與它的生態(tài)相一致的[5-6]。

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（責(zé)任編輯：劉寧寧）