盧護(hù)木，詹振宇，李 蜜，羅雙宇，高程海，羅小衛(wèi)，劉永宏

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院，廣西南寧 530200)

0 引言

抗生素耐藥性是全球范圍內(nèi)普遍存在的公共衛(wèi)生問題，臨床上β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類和氨基糖苷類等抗生素的耐藥性問題日益嚴(yán)重，隨著多重耐藥“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)，抗生素耐藥性問題受到廣泛關(guān)注[1-3]。耐甲氧西林金黃色葡菌球菌(MRSA)自1961年在英國(guó)首次被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，以驚人的速度在世界范圍內(nèi)蔓延。目前，MRSA是引起醫(yī)院感染的重要病原菌之一，對(duì)臨床多種抗生素產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性，其感染人數(shù)已超過(guò)艾滋病、結(jié)核病和病毒性肝炎患病人數(shù),是患者延長(zhǎng)住院時(shí)間和增加醫(yī)療費(fèi)用的重要原因[4-6]。中國(guó)是抗生素生產(chǎn)和使用大國(guó)，由抗生素濫用導(dǎo)致因耐藥菌感染而引起的臨床死亡病例日益增多，挖掘新型抗生素迫在眉睫[7]。海洋占地球表面積的71%，具有廣袤的地理空間及特殊的生態(tài)環(huán)境，孕育著豐富的特色海洋生物資源。作為海洋生物的重要組成部分，海洋微生物長(zhǎng)期棲息在高壓、高鹽、高pH值等特殊生態(tài)環(huán)境，具有獨(dú)特的生理代謝機(jī)制[8]，是新穎復(fù)雜活性天然產(chǎn)物的重要來(lái)源[9]，為新型抗生素的發(fā)現(xiàn)提供化學(xué)實(shí)體[10]。

海洋真菌是海洋微生物的重要組成部分，其來(lái)源廣泛，可以從海洋動(dòng)植物(含紅樹林)、海水及海洋沉積物等載體中分離得到，是近年來(lái)海洋天然產(chǎn)物研究的熱點(diǎn)[11]。海洋真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物具有化學(xué)多樣性，包括生物堿、多肽、聚酮、萜類、甾體等[12]，是抗腫瘤、抗感染等活性分子的重要來(lái)源[13,14]。

廣西北部灣地處熱帶與亞熱帶地區(qū)，其中潿洲島珊瑚礁區(qū)孕育著豐富獨(dú)特的海洋生物資源。這些豐富多樣的海洋生物共附生微生物與宿主在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生化學(xué)防御物質(zhì)，而這些化學(xué)防御物質(zhì)往往具有新穎復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)及廣譜顯著的生物活性。雖然廣西潿洲島珊瑚礁區(qū)海洋微生物資源豐富，但是關(guān)于其海洋微生物活性天然產(chǎn)物的研究起步較晚[15]?；诖耍狙芯繌膹V西潿洲島珊瑚礁區(qū)采集珊瑚、海綿和海藻等北部灣特色海洋生物樣品，利用稀釋分離法從其新鮮組織中初步分離純化菌株，采用現(xiàn)代譜學(xué)分析技術(shù)及抗MRSA活性進(jìn)一步篩選，從而得到代謝產(chǎn)物豐富且具潛在抗菌活性的菌株，為發(fā)現(xiàn)海洋真菌來(lái)源新型抗生素奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

EYELAN-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛郎儀器有限公司)，SHZ-CB型循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)，KQ-250DB 型超聲儀(鞏義市予華儀器有限公司)，立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋(合肥華泰醫(yī)療器械有限公司)，薄層硅膠板(煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司)，Agilent 1260型高效液相色譜儀(安捷倫公司)，Applied Biosystems PCR儀(賽默飛世爾科技公司)，麥芽提取粉(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。海鹽(廣州海利水產(chǎn)有限公司)，提取分析所用試劑乙酸乙酯、甲醇等均為化學(xué)純(廣州化學(xué)試劑廠)，液相色譜用乙腈和甲醇均為色譜純(美國(guó)Merck公司)。

1.1.2 培養(yǎng)基

真菌分離MB培養(yǎng)基：麥芽提取粉15 g，瓊脂粉15 g，海鹽10 g，氯霉素0.2 g，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH值為7.4-7.8，于121℃下高壓蒸汽滅菌30 min，待溫度降至60℃左右，于超凈工作臺(tái)倒平板，冷卻后待用。

MB液體培養(yǎng)基：麥芽提取粉1.5 g，海鹽2 g，蒸餾水100 mL，調(diào)節(jié)pH值為7.4-7.8，用橡膠塞封口，于121℃下高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻后待用。

大米培養(yǎng)基：大米50 g，海鹽1.5 g，蒸餾水75 mL，于121℃下高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻后待用。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，瓊脂粉18 g，海鹽10 g，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH值為7.4-7.8，于121℃下高壓蒸汽滅菌30 min，待溫度降至60℃左右，于超凈工作臺(tái)倒平板，冷卻后待用。

1.2 方法

1.2.1 海洋真菌的分離鑒定

采集廣西潿洲島珊瑚礁區(qū)的葉狀薔薇珊瑚(Montiporafoliosa)、伴綿藻(Ceratodictyonspongiosum)和巢沙菜(Hypneapannosa)等海洋生物樣品(圖1)。將上述海洋生物新鮮組織用清水洗凈并剪斷成長(zhǎng)度為2—3 mm的碎片，用無(wú)菌水漂洗3次后，分別置于盛有無(wú)菌海水的125 mL三角瓶中，在搖床上振蕩10 min (120 r/min)，即成備用菌懸液，然后用無(wú)菌水依次稀釋，取合適梯度濃度的菌懸液涂布于MB平板上，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次，置于26-28℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d，待菌落長(zhǎng)出后，挑取形態(tài)、色澤、大小不同的單菌落在MB平板上重新培養(yǎng)純化。

采用分子生物學(xué)鑒定技術(shù)[16]，根據(jù)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列和系統(tǒng)發(fā)育樹分析對(duì)部分菌株進(jìn)行鑒定。用無(wú)菌牙簽挑取少量真菌菌絲體，置于1.5 mL離心管中，微波法提取真菌基因組DNA[17]。采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG-G-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增分離菌株的rDNA ITS區(qū)。PCR反應(yīng)體系 (25 μL)如下：模板DNA 1 μL，引物(20 μmol/L)各0.5 μL，Premix Taq引物酶12.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增程序如下：94℃ 3 min；94℃ 50 s，52℃ 1 min，72℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，基因測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析，檢索相似性序列，初步鑒定菌株的種屬。

圖1 潿洲島珊瑚礁區(qū)采集的珊瑚、海綿和海藻樣品

1.2.2 海洋真菌的小量發(fā)酵及提取濃縮

對(duì)分離得到的單一菌株采用大米培養(yǎng)基進(jìn)行小量發(fā)酵。同時(shí)，利用500 mL錐形瓶準(zhǔn)備MB液體培養(yǎng)基，滅菌后，將菌株接種至該培養(yǎng)基中，然后于28℃、180 r/min條件下培養(yǎng)2 d，即為種子液。在超凈工作臺(tái)中將種子液接種至已滅菌的大米固體培養(yǎng)基中(4%接種量)，于室溫靜止發(fā)酵30 d。觀察菌株生長(zhǎng)狀態(tài)，發(fā)酵結(jié)束后向大米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中加入等體積乙酸乙酯，搗碎，超聲提取20 min。減壓過(guò)濾后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮濾液，濾渣繼續(xù)用乙酸乙酯反復(fù)提取，至濾液顏色變淺，然后濃縮合并濾液獲得菌株粗提物。

1.2.3 菌體提取物的色譜分析

將菌株粗提物用甲醇溶解配成1 mg/mL的溶液，以毛細(xì)玻璃管吸取5-10 μL，點(diǎn)于硅膠G254薄層板上，揮干甲醇，分別采用二氯甲烷-甲醇(V/V，20∶1)和石油醚-乙酸乙酯(V/V，8∶1)作為展開劑進(jìn)行展開，置于紫外光燈(254 nm)下以及碘缸中顯色觀察。使用0.22 μm濾膜過(guò)濾1 mg/mL菌株粗提物溶液，然后采用HPLC-DAD指紋圖譜分析。色譜條件為色譜柱：YMC-Pack ODS-A,250×4.6 mm LD.,S-5 μm,12 nm；流動(dòng)相：乙腈(95%-100%)/純水，梯度洗脫60 min；檢測(cè)波長(zhǎng)：200-500 nm；柱溫：35℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；采用二極管陣列檢測(cè)器(DAD)檢測(cè)。

1.2.4 菌株提取物的MRSA抑制活性測(cè)試

采用濾紙片瓊脂擴(kuò)散法篩選抑菌活性化合物[18]，將待測(cè)菌株粗提物配成濃度為0.10 mg/mL的甲醇溶液，陽(yáng)性對(duì)照氨芐西林配成0.64 mg/mL的甲醇溶液，甲醇溶液作為陰性對(duì)照。分別用移液槍吸取10 μL待測(cè)樣品溶液于直徑為6 mm的無(wú)菌濾紙片上，待甲醇揮干后，將載樣濾紙片貼于已涂布 100 μL×106CFU/mL MRSA菌懸液的LB培養(yǎng)基上，25℃條件下倒置培養(yǎng)24 h，每隔12 h觀察是否產(chǎn)生抑菌圈。以ds≥1/2dp(ds：粗提物樣品的抑菌圈直徑，dp：陽(yáng)性藥的抑菌圈直徑)的粗提物樣品對(duì)應(yīng)的菌株為具有抗菌活性的菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定結(jié)果

采用稀釋分離法從潿洲島珊瑚礁區(qū)海洋生物中共分離得到40株真菌，其中從葉狀薔薇珊瑚中分離出10株(MF01—MF10)，從巢沙菜中分離出22株(HP01—HP22)，從伴綿藻中分離出8株(CS01-CS08)。通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)代謝產(chǎn)物豐富、活性較好的部分潛力菌株進(jìn)行物種鑒定(表1)，發(fā)現(xiàn)這些菌株主要為曲霉屬Aspergillus(占鑒定菌株中38.1%)和木霉屬Trichoderma(占鑒定菌株中23.8%)。

表1 部分菌株的物種鑒定

續(xù)表1

2.2 色譜分析結(jié)果

薄層色譜(TLC)分析發(fā)現(xiàn)，菌株MF01、MF03、MF06、HP08、HP13、HP17、CS02的大米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物顯色斑點(diǎn)較多，說(shuō)明其代謝產(chǎn)物豐富(圖2)。高效液相色譜(HPLC-DAD)分析結(jié)果表明不同菌株提取物的譜學(xué)特征具有顯著差異，其中菌株 MF01、MF03、MF07、HP01、HP04、HP08、HP16、HP17、HP22、CS02的大米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中代謝產(chǎn)物較為豐富(圖3)。以上TLC和HPLC-DAD分析結(jié)果基本一致。

D：二氯甲烷Dichloromethane；M：甲醇Methanol；P：石油醚Petroleum ether；E：乙酸乙酯Ethyl acetate

圖3 菌株MF01、MF07、HP01和HP08大米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC-DAD指紋圖譜

2.3 抗菌活性篩選結(jié)果

基于濾紙片瓊脂擴(kuò)散法對(duì)40株真菌的大米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抗MRSA活性初步篩選，結(jié)果顯示菌株MF01、MF07、HP01、HP07、HP08、HP17和HP20的大米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物具有一定的抗MRSA活性(表2和圖4)。

表2 菌株大米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的MRSA抑制活性

3 結(jié)論

本研究采用稀釋分離法從廣西潿洲島珊瑚礁區(qū)葉狀薔薇珊瑚、伴綿藻和巢沙菜的新鮮組織中，分離純化獲得40株真菌，其中巢沙菜的共附生真菌最為豐富?；诜肿由飳W(xué)鑒定方法對(duì)菌株進(jìn)行物種鑒定，發(fā)現(xiàn)這些真菌以曲霉屬和木霉屬為主。綜合運(yùn)用薄層層析色譜和HPLC-DAD分析菌株大米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中的化學(xué)多樣性，并結(jié)合基于濾紙片瓊脂擴(kuò)散法的MRSA抑制活性初步篩選研究發(fā)現(xiàn),菌株A.terreusMF01、A.flavusMF07、T.asperellumHP01、F.equisetiHP08和A.unguisHP17不僅具有豐富多樣的次生代謝產(chǎn)物，還具有顯著的MRSA抑制活性，后續(xù)將開展活性代謝產(chǎn)物的發(fā)掘研究，為發(fā)現(xiàn)新型抗MRSA活性分子奠定理論基礎(chǔ)。

圖4 菌株大米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的MRSA抑制活性