梁芳萍，邢楠楠，劉永宏，高程海，張杰良，陳顯強(qiáng)**

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院，廣西南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西中醫(yī)藥科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心/廣西中醫(yī)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530200；3.汕頭大學(xué)理學(xué)院生物系，廣東汕頭 515063)

0 引言

曲酸(Kojic acid)又名麴酸、曲菌酸，具有抗氧化、抗菌、殺蟲、抗腫瘤等廣泛的生物活性，曲酸及其衍生物現(xiàn)已開發(fā)成為護(hù)膚霜、洗液、肥皂和牙科護(hù)理產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于化妝品、食品和制藥工業(yè)等領(lǐng)域[1-3]。醫(yī)學(xué)方面，有研究表明曲酸有望成為治療人角膜內(nèi)皮細(xì)胞衰老相關(guān)疾病的藥物[4]，以及治療和預(yù)防馬爾尼菲藍(lán)狀菌感染的重要輔助藥物[5,6]；另外，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明曲酸具有很強(qiáng)的抗弓形蟲活性[7]。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，曲酸可作為防治飛蝗的有機(jī)磷類殺蟲劑的增效劑[8]。在食品方面，曲酸可保鮮蔬菜，提高食品的保藏品質(zhì)[9]。雖然一些研究發(fā)現(xiàn)曲酸具有一定的致癌作用[10]，但是在有效劑量濃度下曲酸的使用是安全的[1,3]。隨著研究的深入，曲酸的應(yīng)用范圍將會(huì)繼續(xù)擴(kuò)大。

生產(chǎn)曲酸的菌種多見于曲霉屬和青霉屬真菌，如Aspergillusoryzae、A.flavus、A.tamarii、Penicilliumcitrinum、P.griseofulvum、P.purpurogenum和P.rubrum等[11]。這些真菌的曲酸產(chǎn)量與其發(fā)酵工藝密切相關(guān)，發(fā)酵工藝的優(yōu)化是提高曲酸產(chǎn)量的研究熱點(diǎn)。目前，曲酸發(fā)酵工藝的優(yōu)化主要包括碳源、氮源、礦物質(zhì)元素、促進(jìn)劑等培養(yǎng)基成分優(yōu)化和發(fā)酵條件優(yōu)化[12,13]。在曲酸生產(chǎn)中，葡萄糖、蔗糖和淀粉通常用作碳源，蛋白胨和酵母膏則是常用的氮源。另外，部分農(nóng)工副產(chǎn)品也可用作曲酸發(fā)酵的培養(yǎng)基成分，如豆渣、黃漿水、木薯淀粉、白薯粉淀粉酶水解液、柑橘皮渣、豆餅粉、鰹油等[14-16]。魏少鵬等[17]研究發(fā)現(xiàn)在蔗糖與葡萄糖組合作為碳源時(shí)，曲酸產(chǎn)量明顯高于單一碳源，蛋白胨與酵母提取物等有機(jī)氮比無(wú)機(jī)氮更有利于曲酸產(chǎn)量的提高。而低濃度的甲醇、乙醇、氯丙醇等作為添加劑也能夠提高曲酸產(chǎn)量[18]。

本研究從海洋沉積物中發(fā)現(xiàn)一株曲霉Aspergillussp.GXIMD02003，其能夠在大米培養(yǎng)基中產(chǎn)曲酸。為進(jìn)一步提高該真菌的曲酸產(chǎn)量，本研究對(duì)海鹽含量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)曲酸產(chǎn)量的影響進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。曲酸生產(chǎn)在工業(yè)化生產(chǎn)和工藝研究中多采用液體培養(yǎng)基發(fā)酵，但其所需設(shè)備和原料成本較高，因此本研究使用大米固體培養(yǎng)基，旨在規(guī)避曲酸生產(chǎn)中添加原料復(fù)雜、成本高、生產(chǎn)過程煩瑣的問題，簡(jiǎn)化生產(chǎn)過程，從而獲得成本低廉的曲酸原料。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養(yǎng)基

曲酸對(duì)照品，廣州分析測(cè)試中心科力技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)；麥芽提取粉，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)；海鹽，廣東省鹽業(yè)集團(tuán)多品種鹽股份有限公司生產(chǎn)；大米，貴州鴻穗農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司生產(chǎn)；甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮分析級(jí)試劑，均購(gòu)買于成都市科隆化學(xué)品有限公司；甲酸(分析純)和磷酸(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；磷酸二氫鉀(分析純)，廣東光華科技股份有限公司生產(chǎn)；甲醇(色譜純)，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰旧a(chǎn)。

種子培養(yǎng)基：稱取海鹽3 g、麥芽提取粉1.5 g于500 mL錐形瓶中，加入100 mL水和適量玻璃珠，搖勻，在121℃下高壓滅菌20 min，冷卻后備用。

大米固體培養(yǎng)基：稱取75 g大米放入500 mL錐形瓶中，加入75 mL一定濃度的海鹽水，搖勻，在121℃下高壓滅菌20 min，冷卻后備用。

1.2 儀器

LC-2030C 3D Plus型高效液相色譜儀(日本島津)，N-1300V-WB型小型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)，ZWYR-2102型恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司)，HR1500-IIB2型生物安全柜(青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司)，MLS-3781L-PC型高壓滅菌鍋(SANYO Techno Solutions Tottori Co,Ltd.)，SB-5200D型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.3 菌種

菌株分離于廣西潿洲島的海泥，經(jīng)過ITS rDNA基因序列分析，鑒定該菌株為真菌Aspergillussp.，保藏于廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院，編號(hào)為GXIMD02003。

1.4 方法

1.4.1 種子液制備

在生物安全柜中將平板培養(yǎng)基的菌種接種于種子培養(yǎng)基中，在25℃、180 r/min下培養(yǎng)72 h作為種子液。

1.4.2 曲酸發(fā)酵條件考察

(1)最佳鹽度

配制鹽度分別為0、1%、2%、3%、5%、7%的海鹽水溶液，按1.1節(jié)方法制備大米固體培養(yǎng)基，分別接入種子液5 mL，25℃靜置發(fā)酵30 d，每個(gè)濃度取3份樣品測(cè)定曲酸含量，取平均值。

(2)最佳發(fā)酵時(shí)間

使用最佳鹽度制備的大米固體培養(yǎng)基，接入種子液5 mL進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，分別在第15，20，25，30，35，40天取兩份樣品，檢測(cè)曲酸含量，計(jì)算平均值。

1.4.3 發(fā)酵條件驗(yàn)證

在最佳鹽度和發(fā)酵時(shí)間條件下發(fā)酵，高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)曲酸含量，計(jì)算曲酸產(chǎn)量，從而驗(yàn)證研究結(jié)果的可重現(xiàn)性。

1.4.4 曲酸的提取與檢測(cè)

(1)曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取曲酸對(duì)照品5 mg，精密稱量，超純水溶解后，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容至刻度線。配置成0.54 mg/mL曲酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。在使用時(shí)，用超純水稀釋至所需濃度，分別以質(zhì)量濃度為8.44，16.88，33.75，67.5，135 mg/L的曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖。以色譜峰面積(Y)對(duì)樣品溶液的質(zhì)量濃度(X，mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程為Y=24389.37X+2678.94，相關(guān)系數(shù)R=0.999 99 (R2=1)，結(jié)果說明在8.44-135 mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好。

(2)曲酸的提取

曲酸的提取方法基于文獻(xiàn)[19,20]并作適當(dāng)調(diào)整。由于曲酸易溶于水，因此通常采用水作為曲酸的提取溶劑。為確定最佳的提取參數(shù)，本研究考察液料比和超聲提取次數(shù)對(duì)曲酸提取的影響。其提取方法簡(jiǎn)述如下：將發(fā)酵后的大米培養(yǎng)基攪碎，稱取適量樣品，加入一定比例的蒸餾水超聲提取，過濾，合并過濾液;回收溶劑后得到樣品，加入超純水溶解，定容于10 mL容量瓶中備用。

(3)曲酸的高效液相色譜法檢測(cè)

曲酸檢測(cè)參照文獻(xiàn)[19,20]已報(bào)道的方法。色譜柱：Inertsil ODS-SP (5 μm，150 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：2‰磷酸水溶液(A)/甲醇(B)(95∶5) 等度洗脫；流速：1.2 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：269 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 曲酸提取條件的確定

隨著提取溶劑體積的增加，大米培養(yǎng)基中曲酸的提取量均有不同程度提高。方差分析顯示，當(dāng)液料比達(dá)到15∶1后，繼續(xù)增大液料比，曲酸提取率沒有顯著提高，即液料比15∶1和20∶1的提取結(jié)果無(wú)顯著性差異，因此選擇液料比為15∶1(圖1a)。另外，隨著超聲提取次數(shù)的增加，曲酸提取量有所增加，超聲提取1次、2次、3次所得的曲酸含量皆存在顯著性差異，超聲提取4次與超聲提取3次無(wú)顯著性差異(圖1b)。因此，3次為最佳提取次數(shù)。根據(jù)優(yōu)化的結(jié)果，確定液料比15∶1，提取3次為曲酸的最佳提取方案。

圖1 提取條件的考察

2.2 鹽度對(duì)曲酸產(chǎn)量的影響

在0、1%、2%、3%、5%、7%鹽度下，每克大米產(chǎn)生的曲酸量分別是11.9，23.6，24.3，21.7，19.9，19.8 mg (圖2)。結(jié)果表明，隨鹽度的增加，曲酸產(chǎn)量增高，在2%海鹽的培養(yǎng)基中曲酸產(chǎn)量最高；當(dāng)海鹽含量大于2%后，曲酸產(chǎn)量呈稍微下降趨勢(shì)。但總體而言，含有海鹽的大米培養(yǎng)基所產(chǎn)生的曲酸量高于不含海鹽的大米培養(yǎng)基。此外，海鹽含量影響Aspergillussp.代謝產(chǎn)物的復(fù)雜性，如圖3所示，不含海鹽和1%海鹽培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的化學(xué)成分復(fù)雜，非曲酸成分占比較高；而當(dāng)鹽度達(dá)到2%時(shí)，代謝產(chǎn)物成分簡(jiǎn)單，主要為曲酸。

圖2 不同鹽度條件下的曲酸產(chǎn)量

A-F：濃度依次為0、1%、2%、3%、5%、7%的海鹽培養(yǎng)基,G:曲酸對(duì)照品

2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)曲酸產(chǎn)量的影響

在15,20,25,30,35,40 d時(shí)的曲酸產(chǎn)量分別為10.1,13.8,17.0,25.8,26.5,26.2 mg/g (圖4)。隨發(fā)酵時(shí)間增加，曲酸的產(chǎn)量越來(lái)越高，但30 d后曲酸的產(chǎn)量增幅不大。因此，曲酸的最佳發(fā)酵時(shí)間為30 d。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間的曲酸產(chǎn)量

2.4 最佳發(fā)酵條件下的曲酸產(chǎn)量

為進(jìn)一步驗(yàn)證最佳條件下的曲酸產(chǎn)量，采用2%海鹽的大米培養(yǎng)基發(fā)酵30 d，HPLC檢測(cè)曲酸含量，測(cè)得最佳發(fā)酵條件下1 000 g大米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生的曲酸含量為24.2 mg/g (圖5)。

圖5 最佳發(fā)酵條件下的發(fā)酵產(chǎn)物HPLC圖

3 討論

海鹽的主要成分是氯化鈉，氯化鈉對(duì)維持細(xì)胞的正常形態(tài)有重要的作用。當(dāng)鹽度提高到一定濃度后，可能使菌體處于滲透壓相對(duì)較高的狀態(tài)而影響真菌的生長(zhǎng)或刺激真菌自身代謝的酶活性，從而影響代謝產(chǎn)物的變化。與空白組相比，含海鹽大米培養(yǎng)基的曲酸產(chǎn)量均有明顯的增加。另外，海鹽的含量影響Aspergillussp.代謝產(chǎn)物的復(fù)雜性(圖3)，Ola等[21]使用不含鹽的大米培養(yǎng)基培養(yǎng)Aspergillussp.，其代謝產(chǎn)物中主要含曲酸，與本研究結(jié)果不一致，其原因可能是文獻(xiàn)的菌種Aspergillussp.是從植物中分離出，其生長(zhǎng)條件不需要鹽來(lái)維持菌體滲透壓便可產(chǎn)生曲酸。

真菌的發(fā)酵過程可分為真菌生長(zhǎng)階段與代謝產(chǎn)物積累階段。在發(fā)酵的前期階段，大米培養(yǎng)基養(yǎng)分充足，真菌處于生長(zhǎng)繁殖時(shí)期，代謝產(chǎn)物積累相對(duì)較少，曲酸含量相對(duì)較低。隨著真菌大量繁殖，其代謝產(chǎn)物不斷積累，曲酸含量明顯增加，Aspergillussp.GXIMD02003的曲酸產(chǎn)量在發(fā)酵30 d達(dá)到最高，為1 000 g大米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生24.2 g曲酸。李天笑等[22]發(fā)明專利比較米曲霉(A.oryzaeATCC42129)、雜色曲霉菌(A.versicolorATCC28286)以及黃曲霉(A.flavus)、煙曲霉(A.fumigatus)、倫氏曲霉(A.lentulus)在不含鹽的大米固體培養(yǎng)基發(fā)酵的曲酸產(chǎn)量，A.versicolorATCC28286的產(chǎn)量最高，為1 000 g大米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)6.2 g曲酸[22]。本研究采用含鹽大米固體培養(yǎng)基發(fā)酵Aspergillussp.GXIMD02003，所得曲酸產(chǎn)量高于其報(bào)道的雜色曲霉菌(A.versicolorATCC28286)和黃曲霉(A.flavus) 的曲酸產(chǎn)量，分別為3.9倍和22.9倍。

4 結(jié)論

曲酸在生活中被廣泛應(yīng)用，市場(chǎng)需求不斷增加，如何提高曲酸產(chǎn)量備受學(xué)者們關(guān)注，而優(yōu)化真菌發(fā)酵工藝是提高曲酸產(chǎn)量的一種重要方法。本研究發(fā)現(xiàn)海洋來(lái)源真菌Aspergillussp.GXIMD02003能夠產(chǎn)生曲酸，其在含2%海鹽的大米培養(yǎng)基發(fā)酵30 d時(shí)曲酸產(chǎn)量相對(duì)最高。該研究結(jié)果說明海洋來(lái)源真菌Aspergillussp.GXIMD02003可以作為曲酸的生產(chǎn)菌株，海鹽影響該菌株的曲酸代謝。此外，本研究所提供發(fā)酵工藝所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、操作簡(jiǎn)單，利于工業(yè)化生產(chǎn)。