王麗君 李宏松 張文怡 廖丁瑩 楊熹婷 王建明

青光眼是常見(jiàn)的不可逆致盲性眼病，濾過(guò)手術(shù)是抗青光眼的主流治療方法，但術(shù)2年的失敗率高達(dá)15%～30%[1]，研究顯示Tenon’s囊成纖維細(xì)胞(human Tenon fibroblasts，HTFs)的增殖、遷移以及纖維化在濾過(guò)泡瘢痕化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[2，3]。研究HTFs的功能和生長(zhǎng)特性有助于了解濾過(guò)泡瘢痕形成的機(jī)制，也可以為抗濾過(guò)泡瘢痕化藥物的研究提供平臺(tái)。成纖維細(xì)胞的分離及原代培養(yǎng)方法多種多樣，應(yīng)用較多的有組織塊法和酶消化法[4，5]。組織塊法是將組織剪碎后直接鋪于培養(yǎng)皿底部，加培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)數(shù)日培養(yǎng)后細(xì)胞從組織塊周圍貼壁爬出生長(zhǎng)。酶消化法是將組織塊經(jīng)多種蛋白酶消化后種植于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)分離成出纖維細(xì)胞。由于酶消化法步驟繁瑣、所需試劑種類多、操作技術(shù)要求高、易污染等原因，現(xiàn)多采用組織塊法培養(yǎng)原代HTFs。但傳統(tǒng)的組織塊培養(yǎng)方法存在組織塊貼壁率低、細(xì)胞不易爬出、培養(yǎng)效率低的問(wèn)題，為了解決此類問(wèn)題，本研究對(duì)人Tenon’s囊成纖維細(xì)胞的組織塊培養(yǎng)方法進(jìn)行了優(yōu)化，意在探討一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、有效的原代人Tenon’s囊成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法并對(duì)體外培養(yǎng)的HTFs的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。

資料與方法

一、材料

主要實(shí)驗(yàn)材料有胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Gibco公司)、DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司)、0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco公司)、青鏈霉素混合液(索萊寶公司)、PBS(Heart公司)、小鼠抗人波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體(Santa Cruze公司)、小鼠抗人角蛋白(Cytokeratin)單克隆抗體(Abcam公司)、山羊抗小鼠DyLight649二抗(Abbkine公司)、山羊抗兔DyLight649二抗(Abbkine公司)、DAPI(碧云天公司)、山羊血清工作液(中杉金橋公司)、噻唑藍(lán)3-(4，5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyltetrazolium Bromide(sigma公司)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(Sigma公司)、Tween20(索萊寶公司)、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天公司)。

二、實(shí)驗(yàn)儀器

主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)、超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰公司)、倒置顯微鏡(Motic公司)、離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀公司)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BMG LABTECH公司)、熒光顯微鏡(Leica 公司)、流式細(xì)胞儀(ACEA Biosciences公司)。

三、方法

1.取材：采集西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院眼科斜視手術(shù)患者的Tenon’s囊組織，患者無(wú)全身及其他眼部疾病史，無(wú)眼部手術(shù)史且年齡小于18歲。取材過(guò)程中注意避免沾染結(jié)膜上皮組織，置于加有青霉素100 U/ml，鏈霉素0.1mg/ml的無(wú)菌DMEM液中，冰盒儲(chǔ)存，快速轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作。本研究通過(guò)西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(審批號(hào)：(2019)倫審-研第(014)號(hào))。

2.組織細(xì)胞的優(yōu)化培養(yǎng)：無(wú)菌DMEM液沖洗組織塊3次，高壓滅菌的眼科剪剪除血凝塊，將Tenon’s囊組織剪成1～2 mm3組織塊，20%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸組織塊，傾斜培養(yǎng)皿小心吸棄培養(yǎng)液，使組織塊自然、均勻的平鋪于6.0 cm培養(yǎng)皿，組織塊表面滴加FBS利于組織貼壁，傾斜培養(yǎng)皿置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間注意觀察組織塊，避免組織塊干燥，3 h后加1 ml含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液覆蓋組織塊繼續(xù)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后補(bǔ)加培養(yǎng)基2 ml，待細(xì)胞爬出后每2～3 d輕柔半換液法更換培養(yǎng)液至傳代，期間避免用力晃動(dòng)培養(yǎng)皿以防止組織塊脫落。

3.細(xì)胞傳代：當(dāng)細(xì)胞融合到80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙變大時(shí)加入足量含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化。移入離心管，800 r/min離心5min；吸棄上清，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，按照1：3進(jìn)行傳代。

4.細(xì)胞凍存：收集處對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3～4代細(xì)胞，凍存前24 h換液1次，0.25%胰蛋白酶消化后離心收集細(xì)胞，以含10%DMSO的FBS為凍存液，調(diào)整細(xì)胞濃度為4～5×106個(gè)/ml，裝入凍存管中。依次在4 ℃放置10 min，-20 ℃放置30 min，-80 ℃過(guò)夜，最后放置于液氮中長(zhǎng)期凍存。

5.細(xì)胞復(fù)蘇：液氮中取出凍存管，快速置于37 ℃水浴中，不斷搖晃至凍存液完全溶解，將凍存液轉(zhuǎn)入含有10倍體積完全培養(yǎng)基的離心管中，混勻后800 r/min離心5 min，棄上清液，用完全培養(yǎng)基垂懸細(xì)胞后接種于培養(yǎng)瓶中，放置于恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后待細(xì)胞貼壁后換液1次，以后常規(guī)培養(yǎng)。

6.HTFs的形態(tài)學(xué)觀察及免疫熒光細(xì)胞染色鑒定細(xì)胞：在倒置熒光顯微鏡下觀察HTFs的生長(zhǎng)狀態(tài)、數(shù)量、形態(tài)變化等；24孔板的孔內(nèi)放置無(wú)菌玻片1片/孔，以2×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞接種于玻片上。待細(xì)胞密度為80%時(shí)吸棄原培養(yǎng)液，用4 ℃預(yù)冷的PBS輕柔潤(rùn)洗3次，每次3 min。4%多聚甲醛室溫固定15～20 min，吸棄固定液，用4 ℃預(yù)冷的PBS輕柔潤(rùn)洗3次，每次5 min。0.5%Triton～X100室溫放置15 min，通透細(xì)胞膜，PBS輕柔潤(rùn)洗3次，每次5 min。山羊血清工作液封閉，室溫孵育30 min。吸棄封閉液，加入山羊血清工作液稀釋的一抗(Vimentin 1:50，Cytokeratin 1:250)，陰性對(duì)照用PBS代替抗體，4 ℃過(guò)夜。第2天吸棄一抗，PBST輕柔潤(rùn)洗3次，每次5 min。加入DyLight標(biāo)記的二抗(1:50)，室溫放置1 h，注意避光。吸棄二抗，PBST輕柔潤(rùn)洗3次，每次5 min。加入DAPI室溫避光放置5 min進(jìn)行核染。PBST輕柔潤(rùn)洗3次，每次5 min。使用抗熒光猝滅封片劑封片，并于1 h內(nèi)在熒光顯微鏡下觀察并拍照計(jì)算免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞的比例。

7.MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖及生長(zhǎng)曲線：取第3代HTFs，以3000個(gè)/孔接種至96孔板中，每組6個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔，每隔24 h，取6個(gè)孔，加入MTT溶液20 μml(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸盡培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μl，震蕩10 min，酶標(biāo)儀讀取490 nm處的吸光度(OD值)。以時(shí)間(d)為X軸，以O(shè)D值為Y 軸繪制生長(zhǎng)曲線。

8.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的第3～4代HTFs，胰蛋白酶消化制備單細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗滌后，加入1 ml預(yù)冷的70%乙醇中固定，4 ℃固定24 h。離心收集細(xì)胞，加入約1 ml預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。加入染色緩沖液0.5 ml，PI 25 μl、RNase A 10 ml，緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀，37 ℃避光溫浴30 min，隨后可以4 ℃避光存放。當(dāng)日用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)紅色熒光。計(jì)算增殖指數(shù)(proliferation index，PI)。增殖指數(shù)PI=(G2/M+S)/(G2/M+G0/G1+S)×100%。[6]

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、原代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)

組織塊貼壁于培養(yǎng)皿底面，第4～7天可以見(jiàn)長(zhǎng)梭形細(xì)胞從組織塊周圍爬出，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞多為長(zhǎng)梭形(圖1A)，然后細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，2～3周左右大量細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈緊密排列的單層長(zhǎng)梭形或多邊形，放射狀或漩渦狀排列(圖1B)。傳代后細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、多角形(圖1C)，細(xì)胞匯合程度高時(shí)細(xì)胞可呈多邊形改變，呈蝸旋狀或者放射狀聚集(圖1D)，均為典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)。細(xì)胞1:3傳代后4～5 d長(zhǎng)滿，凍存復(fù)蘇后細(xì)胞生長(zhǎng)良好。

二、HTFs生長(zhǎng)曲線

細(xì)胞傳代后0～2 d細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯增長(zhǎng)，處于生長(zhǎng)潛伏期；2 d后細(xì)胞數(shù)明顯增加，生長(zhǎng)曲線斜率增大，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)；6 d細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大值；隨后細(xì)胞數(shù)有所減少，進(jìn)入退化期，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線近似S形(圖2)。此生長(zhǎng)規(guī)律符合一般細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律，生長(zhǎng)曲線結(jié)果提示在第3～5 d細(xì)胞增殖能力顯著。

圖1 Tenon’s囊成纖維細(xì)胞形態(tài)

圖2 Tenon’s囊成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

圖3 Tenon’s囊成纖維細(xì)胞Vimentin及Cytokeratin免疫熒光染色

圖4 Tenon’s囊成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期

三、HTFs鑒定

Vimentin免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿內(nèi)可見(jiàn)與細(xì)胞長(zhǎng)軸方向一致的紅色束狀或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核未染色，Vimentin免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)98%，Cytokeratin免疫熒光染色為陰性，此結(jié)果符合HTFs特性且無(wú)上皮細(xì)胞污染。

四、HTFs的細(xì)胞周期

細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，第3～4代HTFs中(63.48±10.22)%處于G0/G1期，(10.80±5.07)%處于G2/M期，(24.34±8.07)%處于S期(圖4)。PI為35.6%，細(xì)胞增殖活性好。

討 論

HTFs在青光眼濾過(guò)術(shù)后濾過(guò)道瘢痕化的過(guò)程中扮演著重要的角色，HTFs的活化、遷移、增殖，及其合成分泌細(xì)胞外基質(zhì)等都是濾過(guò)泡瘢痕化的重要機(jī)制[2，3]。因此HTFs的成功培養(yǎng)是研究濾過(guò)泡瘢痕化的重要基礎(chǔ)。

HTFs為間質(zhì)來(lái)源細(xì)胞，間質(zhì)來(lái)源的細(xì)胞含有波形蛋白(Vimentin)[7，8]，但在Tenon’s囊組織取材、培養(yǎng)的過(guò)程中很有可能混入結(jié)膜上皮細(xì)胞，結(jié)膜上皮細(xì)胞的沾染會(huì)影響細(xì)胞純度及后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。因此我們采用免疫熒光的方法檢測(cè)所培養(yǎng)細(xì)胞的性質(zhì)和來(lái)源，通過(guò)檢測(cè)HTFs的陽(yáng)性指標(biāo)Vimentin蛋白以及結(jié)膜上皮細(xì)胞的陽(yáng)性指標(biāo)Cytokeratin蛋白，同時(shí)采用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色標(biāo)記，以此來(lái)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比例(陽(yáng)性細(xì)胞/總細(xì)胞×100%)。經(jīng)驗(yàn)證，本研究中所培養(yǎng)的原代細(xì)胞的Vimentin陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)98%，Cytokeratin為陰性。本研究中所培養(yǎng)的細(xì)胞胞體呈長(zhǎng)梭形，可有2～3個(gè)突起，與HTFs的典型形態(tài)學(xué)特征一致。因此，本研究中培養(yǎng)的細(xì)胞是HTFs。

活細(xì)胞可通過(guò)線粒體能量代謝過(guò)程中琥珀酸脫氫酶的作用使淡黃色的MTT分解產(chǎn)生藍(lán)色結(jié)晶狀甲瓚沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍，且形成甲瓚的量與細(xì)胞活性成正比，測(cè)定細(xì)胞活性水平可以間接反映細(xì)胞增殖的情況，MTT法是一種重要的測(cè)定細(xì)胞增殖活性的技術(shù)方法[9]。本研究采用MTT法對(duì)HTFs的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了檢測(cè)，并繪制了細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，得出HTFs在傳代接種后3～5 d生長(zhǎng)旺盛，適合后續(xù)研究。同時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果提示對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HTFs增殖指數(shù)為35.6%，細(xì)胞增殖活性好。

組織塊貼壁培養(yǎng)法是一種應(yīng)用已久的原代細(xì)胞培養(yǎng)方法，但傳統(tǒng)培養(yǎng)方法下Tenon’s囊植塊不易貼壁，加入培養(yǎng)基后極易浮起，從而導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)失敗。因此，我們?cè)趥鹘y(tǒng)組織塊貼壁培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)以提高培養(yǎng)效率。優(yōu)化組織塊貼壁培養(yǎng)的方案主要包括以下幾點(diǎn)：(1)術(shù)中顯微鏡下取材，避免收集的組織中混有結(jié)膜上皮組織，此方法可大大提高原代培養(yǎng)細(xì)胞的純度；(2)20%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸組織塊后傾斜培養(yǎng)皿小心吸棄培養(yǎng)液，使組織塊自然、均勻的平鋪于培養(yǎng)皿底部，這樣組織塊可以保持在液體環(huán)境下的舒展?fàn)顟B(tài)貼合培養(yǎng)皿底，貼合更加緊密；(3)組織塊表面滴加FBS有利于組織塊粘附培養(yǎng)皿底；(4)少量分次添加培養(yǎng)液可防止組織塊浮起；(5)原代細(xì)胞長(zhǎng)出后采用半換液法進(jìn)行培養(yǎng)，可以避免植塊及新生細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境較大的變化。本研究的原代HTFs培養(yǎng)方法較好的解決了Tenon’s囊組織貼壁困難的問(wèn)題，具有方法簡(jiǎn)單、無(wú)需額外添加促生長(zhǎng)細(xì)胞因子、操作步驟少、污染機(jī)會(huì)少等優(yōu)點(diǎn)。

總之，該方法能獲得純度高、活力好的原代人Tenon’s囊成纖維細(xì)胞，是一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、有效的人原代Tenon’s囊成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法，為研究青光眼濾過(guò)泡瘢痕化提供了可靠的靶細(xì)胞模型。