龔紹慧，鄢騰峰，呂世剛，葉敏華，吳淼經(jīng)，祝新根

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，南昌 330006)

膠質(zhì)瘤常見(jiàn)于成年人，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為惡性的原發(fā)性腫瘤[1]。在過(guò)去的10年中，膠質(zhì)瘤的治療方式主要是手術(shù)治療和聯(lián)合放化療[2]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制得到了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，在膠質(zhì)瘤的分子研究中已描述了幾種遺傳和表觀遺傳學(xué)的改變[3-4]。因此，探索更多新的潛在分子機(jī)制對(duì)于膠質(zhì)瘤的分子治療有著重要意義。本研究探討miR-586對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 樣本及細(xì)胞系

人腦組織標(biāo)本包括6例非腫瘤腦組織和30例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腦組織標(biāo)本，均來(lái)自南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，經(jīng)患者及家屬知情并簽署知情同意書(shū)后，將標(biāo)本留取并放在液氮罐中凍存。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

取出在液氮中凍存的膠質(zhì)瘤細(xì)胞及人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞，用含10%血清的培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的U87細(xì)胞，按照Lipofectamine 3000試劑(美國(guó)Invitrogen公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在培養(yǎng)24～48 h后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)

按照PCR試劑盒(廣州市銳博生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，得到各組循環(huán)閾值(CT值)，以GAPDH作為內(nèi)參基因，計(jì)算2-ΔΔCt值。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)

按照每孔2000個(gè)細(xì)胞種植在96孔板中，按照CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書(shū)，分別在0、24、48、72、96 h時(shí)，在對(duì)應(yīng)孔中加入CCK-8試劑，并在酶標(biāo)儀上設(shè)定CCK-8檢測(cè)參數(shù)(450 nm波長(zhǎng)處的吸光度)后，重復(fù)測(cè)量3次吸光度，繪制生長(zhǎng)曲線，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)

取細(xì)胞狀態(tài)良好，并且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化，按照細(xì)胞周期試劑盒(廣州市銳博生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)，加入完全培養(yǎng)基終止消化；離心，加入完全培養(yǎng)基輕輕吹打重懸，用移液槍將重懸液吸入六孔板中，48 h后收集細(xì)胞。吸取PBS洗滌2遍，消化細(xì)胞，1500 r·min-1離心5 min，棄上清。用PBS洗2遍，1500 r·min-1離心5 min，棄上清，用殘余的液體重懸細(xì)胞。用-20 ℃預(yù)冷的75%乙醇重懸細(xì)胞，封口膜封閉流式管管口，-20 ℃保存過(guò)夜。1 mL PBS洗1遍，1500 r·min-1離心5 min，棄上清。加入200 μL的DNA staining solution,震蕩10 s，室溫避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)為至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值。組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和非腫瘤腦組織中miR-586表達(dá)的比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)顯示：miR-586在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)顯著高于非腫瘤腦組織中的表達(dá)(P<0.001，圖1A)；膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中miR-586的表達(dá)水平也高于正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，其中U87細(xì)胞中miR-586的表達(dá)水平顯著高于人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞(P<0.05,圖1B)。

2.2 下調(diào)miR-586表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示：使用miR-586 inhibitor轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞抑制miR-586表達(dá)后，U87細(xì)胞的增殖能力明顯下降(P<0.01，圖2)。

2.3 下調(diào)miR-586表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)顯示：使用miR-586 inhibitor轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞抑制miR-586表達(dá)后，U87細(xì)胞周期處于G0/G1期細(xì)胞數(shù)量明顯增加，處于S期減少(P<0.01，圖3)。

3 討論

膠質(zhì)瘤起源于前體細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，由于廣泛的顱內(nèi)侵襲性，患者2年生存率較低[5-6]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，在分子層面探究更多的腫瘤治療靶點(diǎn)十分必要。有研究[7-8]表明，miRNA在疾病進(jìn)展(包括腫瘤發(fā)生和腫瘤進(jìn)展等)中，是涉及這些生物過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。并且miRNA可以在多個(gè)方面影響生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡[9]。

本研究聚焦于miR-586對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑制miR-586能夠?qū)е耈87細(xì)胞增殖能力明顯下降。YANG等[10]發(fā)現(xiàn)抑制miR-586的表達(dá)能夠誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期，過(guò)表達(dá)miR-586則得出了相反的結(jié)論。本研究也得出了同樣的結(jié)論，通過(guò)構(gòu)建miR-586 inhibitor質(zhì)粒降低miR-586的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)抑制miR-586能將U87細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期(圖3)。這也再次表明抑制miR-586能夠影響腫瘤細(xì)胞周期階段。有研究[11]報(bào)道，miR-181a和miR-181b在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用。相反，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞瘤患者中發(fā)現(xiàn)miR-1238高表達(dá)與替莫唑胺耐藥顯著相關(guān)[12]。因此，miRNA的失調(diào)被認(rèn)為是膠質(zhì)瘤治療的一個(gè)方向。

綜上所述，本研究對(duì)miR-586在人膠質(zhì)瘤中表達(dá)和對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)miR-586在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，抑制miR-586的表達(dá)可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，為膠質(zhì)瘤分子治療提供了新的方向。明確miR-586影響膠質(zhì)瘤的機(jī)制還需要更進(jìn)一步的探索研究。