王冰，王軍，楊忠，王會(huì)如（通信作者）

1 北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所 （北京 101111）；2 北京理工大學(xué)生命學(xué)院 （北京 100081）

腫瘤個(gè)體化治療需要闡明個(gè)體患者的遺傳傾向、腫瘤組織組成、腫瘤組織學(xué)圖譜、組織微環(huán)境、并發(fā)癥、生活方式和生命質(zhì)量等各個(gè)方面[1]。腫瘤的形成是一個(gè)多步驟的過(guò)程，究其根本是由遺傳變異的積累所導(dǎo)致的。這些遺傳變異包括腫瘤驅(qū)動(dòng)基因或抑癌基因的拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）、單核苷酸變異（single nucleotide variants，SNV）、插入缺失突變（insertion-deletion mutation，In/Del）、融合變異（fusion mutation）及染色體倍性的變化[2]。腫瘤驅(qū)動(dòng)基因CNV是腫瘤細(xì)胞基因組變異檢測(cè)的重要生物標(biāo)志物，臨床上針對(duì)發(fā)生CNV的靶標(biāo)選擇合適的靶向藥物，合理改進(jìn)治療方案，使治療更有針對(duì)性，避免患者產(chǎn)生不良反應(yīng)及過(guò)度醫(yī)療的發(fā)生。

分子診斷試劑、生化診斷試劑與免疫診斷試劑共同組成了體外診斷（in vitro diagnostics，IVD）試劑的版圖，其中，腫瘤驅(qū)動(dòng)基因CNV 的檢測(cè)也覆蓋了IVD 試劑的各個(gè)層面。熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）和免疫組化（immunohistochemistry，IHC）是臨床上檢測(cè)腫瘤組織驅(qū)動(dòng)基因CNV 的常規(guī)方法，但只能定性地對(duì)CNV 進(jìn)行分析?；驒z測(cè)技術(shù)的創(chuàng)新和迭代使得CNV 的定量檢測(cè)成為可能，在腫瘤驅(qū)動(dòng)基因CNV 檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢(shì)。但是，基因檢測(cè)技術(shù)對(duì)檢測(cè)環(huán)境要求高，操作流程復(fù)雜，樣本制備和檢測(cè)流程標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化程度低，且人員操作的熟練度和規(guī)范程度各不相同，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果存在較大差異，缺乏可比性。因此，研制用于CNV 檢測(cè)的分子IVD 試劑溯源的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對(duì)助力腫瘤驅(qū)動(dòng)基因CNV 分子診斷試劑的研發(fā)、注冊(cè)和監(jiān)管以及分子實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的規(guī)范和提升具有重要意義。

1 腫瘤驅(qū)動(dòng)基因CNV 致癌機(jī)制

CNV 是遺傳變異的重要來(lái)源，是一種大于1 kb 的DNA片段的變異，變異片段發(fā)生重復(fù)且與個(gè)體間基因組片段重復(fù)數(shù)量存在差異[3]，包括了缺失、重復(fù)、倒位及易位等多種變異形式，極大地豐富了基因組遺傳變異的多樣性[4]。CNV 在人類基因組中廣泛分布，一般表現(xiàn)為兩種模式：一種是有絲分裂過(guò)程中染色體分離異常而發(fā)生的廣泛性CNV（broader CNV，bCNV），重復(fù)區(qū)域可以發(fā)生在染色體臂的大部分區(qū)域[5]；另一種是由于DNA 的修復(fù)錯(cuò)誤導(dǎo)致的發(fā)生在染色體臂小范圍內(nèi)的局灶性CNV（focal CNV，fCNV）[6]。fCNV 更頻繁地發(fā)生在腫瘤驅(qū)動(dòng)基因上[3，7]。CNV 如果發(fā)生在腫瘤相關(guān)基因序列內(nèi)部或周圍可能引起癌基因激活、抑癌基因失活.最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。CNV 通過(guò)改變基因劑量、調(diào)節(jié)基因活性影響基因表達(dá)、表型差異和表型適應(yīng)，從而引起腫瘤以及其他遺傳疾病[8]。

Diskin 等[9]分析了成神經(jīng)細(xì)胞瘤易感基因的CNV，發(fā)現(xiàn)1q21.1區(qū)域的CNV 與成神經(jīng)細(xì)胞瘤的發(fā)生高度相關(guān)，該區(qū)域拷貝數(shù)的變化使得成神經(jīng)細(xì)胞瘤斷裂點(diǎn)家族23（neuroblastoma breakpoint family 23，NBPF23）的基因表達(dá)量顯著上調(diào)。紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center，MSK）Chris Sander 團(tuán)隊(duì)利用癌癥基因組圖譜TCGA 中涉及12個(gè)腫瘤類型的3 299個(gè)腫瘤組織樣本基因組學(xué)數(shù)據(jù)，提取了數(shù)千個(gè)發(fā)生變異的遺傳和表觀遺傳特征，將所有腫瘤分為體細(xì)胞基因突變類（mutations，M Class）和拷貝數(shù)變化類（copy number changes，C class），多種類型的肺癌、乳腺癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌等都屬于C 類。這些腫瘤CNV 研究對(duì)于今后C 類腫瘤患者的治療是至關(guān)重要的[10]。有研究顯示，在非小細(xì)胞肺癌中，CNV 和免疫相關(guān)基因表達(dá)譜（gene expression profiling，GEP）在預(yù)測(cè)免疫治療臨床獲益方面有重要價(jià)值[11]。胃腸道腫瘤免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune-checkpoint-blockade，ICB）治療中，CNV 的預(yù)測(cè)和預(yù)后價(jià)值存在顯著相關(guān)性。Lu 等采用全外顯子測(cè)序等方法，比較分析了CNV 負(fù)荷、腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden，TMB）和程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）等分子特征在胃腸道腫瘤患者的預(yù)測(cè)及預(yù)后意義。結(jié)果表明，腫瘤CNV 負(fù)荷與胃腸道腫瘤患者免疫治療臨床獲益相關(guān)，且較低的CNV 負(fù)荷的患者接受ICB 治療療效及預(yù)后較好。CNV 負(fù)荷有成為新的胃腸道腫瘤免疫治療生物標(biāo)志物的巨大潛力[12]。

在如肺癌、乳腺癌和胃癌等許多人類惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制中，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體基因（epidermal growth factor receptor，EGFR）、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2基因（human epidermal growth factor receptor 2，HER2 ）以及間質(zhì) - 上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子基因（mesenchymal-epithelial transition factor,MET）的擴(kuò)增和由此導(dǎo)致的對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)表達(dá)量的增加發(fā)揮了重要作用。

EGFR也稱受體酪氨酸激酶1基因（receptor tyrosineprotein kinase erbB-1, ERBB1），位于人7號(hào)染色體短臂上，長(zhǎng)度約192 kbp，含有28個(gè)外顯子，屬于人類表皮因子受體基因家族4個(gè)成員之一。EGFR屬于表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體，主要由胞外功能區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3部分組成。其中胞外功能區(qū)是聯(lián)結(jié)EGF的主要配體，胞內(nèi)區(qū)存在突出的酪氨酸激酶活性物質(zhì)，當(dāng)EGFR聯(lián)結(jié)于配體后，于細(xì)胞外組成同源二聚體、異源二聚體等物質(zhì)，并隨著二聚體內(nèi)陷變化，而出現(xiàn)構(gòu)象變化，導(dǎo)致分子自身逐漸磷酸化激活，形成有絲分裂樣表現(xiàn)，酪氨酸經(jīng)磷酸化后，可激活分子位點(diǎn)、引發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制及激活下游等多個(gè)通路。其中EGFR的18-21號(hào)外顯子編碼酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域發(fā)生突變后一般會(huì)導(dǎo)致該結(jié)構(gòu)域活性增強(qiáng)。小分子抑制劑與該區(qū)域結(jié)合，阻止受體出現(xiàn)磷酸化，阻斷下游信號(hào)通路[13]。研究認(rèn)為EGFR基因的擴(kuò)增與胃-食管交界處和遠(yuǎn)端食管的腸道腺癌[14]以及非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[15]的發(fā)生相關(guān)聯(lián)，可以作為判斷響應(yīng)抗EGFR靶向治療的療效和預(yù)后的生物標(biāo)記物。Knebel等通過(guò)對(duì)NSCLC患者連續(xù)抽血進(jìn)行液體活檢來(lái)檢測(cè)EGFR的突變，提出了“EGFR的擴(kuò)增是NSCLC患者對(duì)奧希替尼（osimertinib）產(chǎn)生耐藥性的一種機(jī)制”的假說(shuō)[16]。

HER2基因也稱為受體酪氨酸激酶2基因（receptor tyrosine-protein kinase erb-2，ERBB2），位于人17號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，長(zhǎng)度約為42.5 kbp，含有31個(gè)外顯子，屬于人類表皮因子受體基因家族4個(gè)成員之一，該家族表達(dá)酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases，RTKs）跨膜蛋白受體[17]。HER-2蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要有Ras/Raf/分裂素活化 蛋 白 激 酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑、磷脂酰肌醇-3-羥基激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）/Akt 途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活（signal transducer and activator of transcription，STAT） 途 徑 等[18-20]。 這 些 通路與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，HER2發(fā)生擴(kuò)增時(shí)，其蛋白質(zhì)表達(dá)量增加，進(jìn)而開(kāi)啟上述信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞快速增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促使腫瘤的形成[21]。研究認(rèn)為，HER2的擴(kuò)增與乳腺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)[22]。在HER2發(fā)生擴(kuò)增的乳腺癌治療過(guò)程中，針對(duì)HER2的單克隆抗體能夠極大改善HER2陽(yáng)性乳腺癌患者的預(yù)后，例如曲妥珠單抗（trastuzumab）就有非常好的療效[23]。

MET 基因表達(dá)的蛋白質(zhì)一般稱為c-MET，位于人7號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，長(zhǎng)度約為125 kb，含有21個(gè)外顯子，是一種具有高度結(jié)合性的受體酪氨酸激酶，屬于RON 亞族。MET 在多種人類腫瘤中呈現(xiàn)異常表達(dá)，表現(xiàn)為細(xì)胞活性異?；蛘哌z傳信息的改變[24]。c-MET 是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）唯一已知受體。HGF 與c-Met 胞外域結(jié)合后，誘導(dǎo)c-Met 激酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生磷酸化，激活下游信號(hào)通路，引起蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK），進(jìn)而激活酪氨酸殘基自身磷酸化，激活PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路，信號(hào)傳導(dǎo)入細(xì)胞核，促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化或引起細(xì)胞形態(tài)改變及侵襲運(yùn)動(dòng)。NSCLC 中，c-MET磷酸化激活下游PI3K/Akt 通路，導(dǎo)致腫瘤對(duì)吉非替尼耐藥。c-MET 小分子酪氨酸酶抑制劑也是目前臨床試驗(yàn)廣泛研究的重點(diǎn)[25]。c-MET 蛋白的表達(dá)情況也與乳腺癌[26]、結(jié)直腸癌[27]以及胃癌[28]等癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

2 腫瘤驅(qū)動(dòng)基因CNV 檢測(cè)方法比較

FISH是檢測(cè)細(xì)胞核基因組CNV的傳統(tǒng)方法，IHC進(jìn)一步驗(yàn)證該基因擴(kuò)增后蛋白質(zhì)表達(dá)量的水平，但這兩種方法實(shí)驗(yàn)過(guò)程煩瑣、周期長(zhǎng)、檢測(cè)成本偏高，而且需要經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師對(duì)結(jié)果進(jìn)行解讀，對(duì)結(jié)果的解釋主觀性較強(qiáng)[29]。隨著遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和基因組學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，出現(xiàn)了多種檢測(cè)CNV的方法，包括比較基因組雜交（comparative genome hybridization，CGH）、多重鏈接探針擴(kuò)增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）、SNP芯片（SNP-chip microarray）、定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）、數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（digital polymerase chain reaction，dPCR）以及高通量測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）等。隨著NGS和dPCR技術(shù)的迅速發(fā)展，使得此兩種技術(shù)用于CNV檢測(cè)優(yōu)勢(shì)得到凸顯，能夠克服傳統(tǒng)方法的只能定性不能定量的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)CNV的絕對(duì)定量[30]。

但是NGS 與第三代PCR 新技術(shù)dPCR 相比，其在對(duì)CNV 進(jìn)行定值時(shí)會(huì)呈現(xiàn)高度的復(fù)雜性。美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技 術(shù) 研 究 院（National Institute of Standards and Technology，NIST）開(kāi)發(fā)了兩套適用于腫瘤驅(qū)動(dòng)基因CNV 檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，一套是基于qPCR 和dPCR 技術(shù)定值的HER2基因拷貝數(shù)變化的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)2373（standard reference material?2373，SRM 2373），對(duì)5個(gè)細(xì)胞系的HER2拷貝數(shù)比率進(jìn)行了賦值，并評(píng)定了其不確定度[31]；另一套是僅使用dPCR方法定值的EGFR 和MET 基因拷貝數(shù)變化的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)8366（reference material 8366，RM 8366），對(duì)6個(gè)細(xì)胞系的EGFR 和MET 基因的拷貝數(shù)比率進(jìn)行了賦值，并評(píng)定了其不確定度[32]。Lih 等使用該HER2的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比較了不同測(cè)序方法檢測(cè)HER2拷貝數(shù)的能力，包括了靶向區(qū)域測(cè)序、全外顯子測(cè)序以及全基因組測(cè)序。盡管不同NGS 測(cè)序方法對(duì)HER2 CNV 的檢測(cè)呈現(xiàn)較好的重復(fù)性，但是仍表現(xiàn)出基于平臺(tái)特異性的拷貝數(shù)檢測(cè)值之間的偏倚。這與不同實(shí)驗(yàn)室間所用建庫(kù)方法和生物信息分析流程的差異高度相關(guān)。而dPCR 由于其簡(jiǎn)便的實(shí)驗(yàn)流程和分析方法，使得不同dPCR平臺(tái)間的分析結(jié)果更具可比性，準(zhǔn)確度和精確度更高[33]。He 等同樣利用包括全基因組測(cè)序、全外顯子組測(cè)序和靶向區(qū)域測(cè)序（2個(gè)不同的泛癌種多基因panel）的NGS 方法對(duì)RM 8366的EGFR 和MET 基因的拷貝數(shù)比率進(jìn)行測(cè)定，并與dPCR 方法賦予的量值進(jìn)行比較。結(jié)果顯示其中5個(gè)細(xì)胞系中，NGS 與dPCR 的檢測(cè)結(jié)果具有比較好的一致性（20%以內(nèi)的偏差），只在另外1個(gè)細(xì)胞系中，NGS 的檢測(cè)結(jié)果顯著偏低。這與Lih 等的研究結(jié)論類似，不同的NGS 方法之間的檢測(cè)結(jié)果間會(huì)呈現(xiàn)可見(jiàn)的差異[32]。研究證實(shí)，dPCR 對(duì)CNV 的檢測(cè)分辨力可以低至0.1個(gè)拷貝[34]。隨著dPCR 技術(shù)的進(jìn)步，其在CNV 檢測(cè)方面的研究也越來(lái)越多，dPCR 必然隨著大量臨床數(shù)據(jù)的積累和檢測(cè)成本的降低在臨床上得到進(jìn)一步推廣。由于其檢測(cè)流程的簡(jiǎn)便性和對(duì)檢測(cè)結(jié)果的精確定值，未來(lái)可與NGS、FISH 和IHC 等方法互為補(bǔ)充。

然而dPCR 技術(shù)仍面臨諸多不足和挑戰(zhàn)，例如腫瘤組織或者體液類樣本的高度異質(zhì)性、腫瘤細(xì)胞比例偏低、所用引物的擴(kuò)增效率，以及檢測(cè)限或者灰區(qū)的確定都有可能造成CNV 臨床檢測(cè)結(jié)果的假陰性或者假陽(yáng)性。因此dPCR儀器的性能、dPCR 診斷試劑盒適用的檢測(cè)范圍和分析結(jié)果的可靠性等問(wèn)題是CNV 檢測(cè)能否順利實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵影響因素。因此，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)于CNV 檢測(cè)是必不可少的，是衡量檢測(cè)結(jié)果是否準(zhǔn)確的一把標(biāo)尺。

對(duì)各種技術(shù)分析的匯總見(jiàn)表1。

3 腫瘤驅(qū)動(dòng)基因CNV IVD 試劑的現(xiàn)狀

應(yīng)用于臨床的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因CNV 檢測(cè)試劑必須依據(jù)相關(guān)的法律法規(guī)由國(guó)家相關(guān)部門(mén)進(jìn)行監(jiān)督管理，試劑又分為取得醫(yī)療器械注冊(cè)證的商品化IVD 試劑和實(shí)驗(yàn)室自建方法（laboratory-developed tests，LDTs）兩類。IVD 試劑注冊(cè)和上市后的監(jiān)管屬于國(guó)家藥品監(jiān)督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）所屬相關(guān)部門(mén)的工作職責(zé)，LDTs 屬于臨床實(shí)驗(yàn)室監(jiān)管的部分[35]。

3.1 取得醫(yī)療器械注冊(cè)證的商品化IVD 試劑

在檢測(cè)CNV 的方法中，由于FISH、qPCR 和dPCR 等技術(shù)相對(duì)于NGS，具有檢測(cè)流程簡(jiǎn)單、周期短和檢測(cè)靶標(biāo)較少的特點(diǎn)，適合開(kāi)發(fā)成商品化試劑盒并以取得醫(yī)療器械注冊(cè)證的形式應(yīng)用于臨床。若基于NGS 技術(shù)開(kāi)發(fā)的試劑盒檢測(cè)靶點(diǎn)明確且較少，亦可以通過(guò)此種方式進(jìn)入臨床。根據(jù)《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》，與腫瘤驅(qū)動(dòng)基因CNV檢測(cè)相關(guān)的試劑均屬于第三類產(chǎn)品，需經(jīng)藥品監(jiān)督管理部門(mén)審批注冊(cè)，方可進(jìn)入臨床[36]。目前已經(jīng)取得醫(yī)療器械注冊(cè)證的檢測(cè)CNV 的IVD 試劑包括了FISH、qPCR 和dPCR等方法。

表1 腫瘤驅(qū)動(dòng)基因組CNV 檢測(cè)方法比較

3.2 LDTs

在國(guó)家精準(zhǔn)醫(yī)療戰(zhàn)略大背景下，基于NGS 的腫瘤基因測(cè)序正在被臨床接受和認(rèn)可。NGS 可以同時(shí)檢測(cè)更多的靶標(biāo)和變異類型，不但可以檢測(cè)已知變異，還可以發(fā)現(xiàn)更多與疾病相關(guān)的未知變異。正是由于NGS 可以檢測(cè)成百上千甚至數(shù)十萬(wàn)個(gè)位點(diǎn)，甚至是全基因組測(cè)序30億個(gè)堿基的檢測(cè)，很難按照IVD 注冊(cè)的要求對(duì)每個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的分析有效性和臨床有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)。將CNV 與SNP、Fusion 和TMB 等腫瘤生物標(biāo)志物放在一起進(jìn)行檢測(cè)，尤其是最新研究證實(shí)CNV 負(fù)荷也可以作為免疫治療的生物標(biāo)志物[37]，選用數(shù)百個(gè)基因大panel 的靶向測(cè)序或者全外顯子組測(cè)序是最優(yōu)選擇。由于方法的高度復(fù)雜性，基因變異研究、藥物研發(fā)進(jìn)展與日俱進(jìn)，建庫(kù)方法、數(shù)據(jù)庫(kù)和分析軟件頻發(fā)地更新迭代，以LDTs 的形式進(jìn)入臨床是最合適的選擇，并以風(fēng)險(xiǎn)管理的方式由相關(guān)部門(mén)進(jìn)行監(jiān)管。例如美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的 MSK 的可檢測(cè)468個(gè)基因的 IMPACT NGS 檢測(cè)試劑和Foundation Medicine 的 可 檢 測(cè)324個(gè) 基 因 的 FoundationOne CDx（F1CDx）檢測(cè)試劑，均為L(zhǎng)DTs，并非是可用于銷售的IVD 產(chǎn)品，只能在申報(bào)批準(zhǔn)的CLIA 認(rèn)證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測(cè)，這也是與美國(guó)的醫(yī)療保險(xiǎn)制度有關(guān)[35]。隨著我國(guó)《醫(yī)療器械監(jiān)督管理?xiàng)l例》的不斷完善和成熟，國(guó)家對(duì)LDTs 的監(jiān)管也將更合理規(guī)范。

無(wú)論腫瘤驅(qū)動(dòng)基因CNV 檢測(cè)試劑是以檢測(cè)較少靶點(diǎn)的IVD 商品化試劑，還是以將多種生物標(biāo)志物糅合在數(shù)百個(gè)基因大panel 的LDTs 的形式服務(wù)于臨床，從監(jiān)管的角度對(duì)試劑本身的質(zhì)量要求是一致的。而如何使檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，需要腫瘤驅(qū)動(dòng)基因CNV 核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的應(yīng)用。從CNV 檢測(cè)試劑的研發(fā)、生產(chǎn)和使用的各個(gè)階段，從產(chǎn)品質(zhì)量控制和校準(zhǔn)的角度，都需要有參照標(biāo)準(zhǔn)，即標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

4 腫瘤驅(qū)動(dòng)基因CNV 核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制進(jìn)展

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（reference materials，RM）是指具有足夠均勻和穩(wěn)定的特定特性的物質(zhì)，其特性適用于測(cè)量或標(biāo)稱特性檢查中的預(yù)期用途[38]。經(jīng)過(guò)賦值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以用于校準(zhǔn)、測(cè)量準(zhǔn)確度控制以及測(cè)量精密度控制。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在校準(zhǔn)測(cè)量?jī)x器、評(píng)價(jià)測(cè)量分析方法、測(cè)量物質(zhì)特性值和考核操作分析人員的操作技術(shù)水平，以及生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)品的質(zhì)量控制等領(lǐng)域具有不可或缺的作用。使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通過(guò)對(duì)儀器和試劑進(jìn)行校準(zhǔn)、對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，可以有效減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是臨床分子診斷標(biāo)準(zhǔn)化的核心，臨床檢測(cè)的某一標(biāo)本中特定標(biāo)志物的量值，不管用何種方法測(cè)定，均可以通過(guò)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化物質(zhì)，而得到相近的結(jié)果，其量值均可溯源至同一標(biāo)準(zhǔn)，從而具有可比性[39]。

按照對(duì)IVD 試劑監(jiān)管的要求，診斷試劑在注冊(cè)檢驗(yàn)階段需要使用國(guó)家參考品或者標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)試劑盒的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，實(shí)現(xiàn)溯源的要求[36，40]。目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有推出腫瘤驅(qū)動(dòng)基因CNV 檢測(cè)的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或者國(guó)家參考品。因此，研發(fā)腫瘤驅(qū)動(dòng)基因CNV 檢測(cè)用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，滿足IVD 領(lǐng)域的市場(chǎng)需求，規(guī)范行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義。在CNV 分子診斷試劑研發(fā)、注冊(cè)、上市后的監(jiān)督抽驗(yàn)以及實(shí)際的臨床檢驗(yàn)中，采用可靠的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是定性和定量測(cè)量方法的性能確認(rèn)和驗(yàn)證、測(cè)量方法產(chǎn)品校準(zhǔn)品的量值傳遞、實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行測(cè)量程序的質(zhì)量控制以及能力比對(duì)和驗(yàn)證的基礎(chǔ)和保障。NIST 發(fā)布了SRM 2373和RM 8336兩種用于腫瘤驅(qū)動(dòng)基因CNV 檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其中前者用于HER2 CNV 的檢測(cè)，后者用于對(duì)EGFR 和MET 兩個(gè)基因CNV 的檢測(cè)，適用于dPCR 以及NGS 等檢測(cè)方法。兩套標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均以目的基因發(fā)生CNV 的永生化腫瘤細(xì)胞系為原材料進(jìn)行培養(yǎng)，提取核基因組DNA 制備得到CNV 水平不同的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)核酸溶液。SRM 2373由標(biāo)物研制實(shí)驗(yàn)室使用qPCR 和dPCR 方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值進(jìn)行賦值和不確定度評(píng)定。RM 8366僅使用dPCR 方法在標(biāo)物研制實(shí)驗(yàn)室完成了定值和不確定度評(píng)定，這是因?yàn)閐PCR 在拷貝數(shù)絕對(duì)定量的準(zhǔn)確度方面是顯著高于qPCR 的。特性值是以拷貝數(shù)比率來(lái)表示，即靶基因的拷貝數(shù)濃度與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)濃度的比值。隨后，RM 8366的特性值又在另外2家實(shí)驗(yàn)室的數(shù)字PCR 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，2家實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果與NIST 的特性值都呈現(xiàn)非常好的相關(guān)性[31-33]。這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)將有助于提高使用dPCR 和NGS 方法研究和臨床檢測(cè)重要腫瘤治療靶點(diǎn)的CNV 的準(zhǔn)確度和可信度。

5 小結(jié)

腫瘤驅(qū)動(dòng)基因CNV 作為腫瘤細(xì)胞基因組中的一種重要變異類型，是腫瘤患者靶向治療、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)價(jià)的重要生物標(biāo)志物，CNV 負(fù)荷在免疫治療中發(fā)揮的重要價(jià)值正在被越來(lái)越多的研究證實(shí)。依據(jù)檢測(cè)靶標(biāo)的類型、數(shù)目以及所用的方法，靈活選擇是包裝成商品化試劑盒通過(guò)NMPA 的注冊(cè)審批，還是以LDTs 的形式進(jìn)入臨床應(yīng)用。技術(shù)的進(jìn)步和法律法規(guī)的不斷完善也推動(dòng)監(jiān)管機(jī)構(gòu)研制出權(quán)威的、有證的、不同應(yīng)用場(chǎng)景的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因CNV 核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，為CNV 檢測(cè)系統(tǒng)的量值溯源和質(zhì)量管理提供支撐，實(shí)現(xiàn)CNV 從定性檢測(cè)向精確定量檢測(cè)的真正轉(zhuǎn)變。