黃俊文 喬潔 梅子 陳茁 李楊 喬彬

1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科 鄭州450052；2.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 省部共建生物催化與酶工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 武漢430062

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcino?ma，OSCC）為常見腫瘤之一，其中每年新發(fā)病例約35.5 萬例，死亡病例約17.7 萬例[1]。近年來，有關(guān)OSCC 的診治取得很大進(jìn)展。盡管如此，國外流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2019 年OSCC 的發(fā)病率和死亡率依舊達(dá)到3.71%和2.41%[2]。究其原因，除了有限的治療手段等因素外，腫瘤微環(huán)境與癌癥細(xì)胞間的相互作用在OSCC 的發(fā)生發(fā)展以及不良預(yù)后中扮演著重要角色。炎癥是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，與人類20%的腫瘤有關(guān)[3]，被認(rèn)為是惡性腫瘤八大特征之一[4]。

脂多糖結(jié)合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）是1 種主要由肝細(xì)胞合成的相對(duì)分子質(zhì)量為6×104的Ⅰ型急性期反應(yīng)糖蛋白[5]。LBP在調(diào)節(jié)感染或炎癥疾病引起的全身炎癥反應(yīng)中起到重要作用[6]，其對(duì)宿主免疫調(diào)節(jié)的作用主要是通過脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）介導(dǎo)的信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。即LBP 參與LPS 向分化抗原簇14（cluster of differentiation 14，CD14）的轉(zhuǎn)移，然后 通 過Toll 樣 受 體4 （Toll?like receptor，TLR4）信號(hào)途徑激活巨噬細(xì)胞，從而引發(fā)先天性免疫反應(yīng)[7?8]。另有研究報(bào)道，LBP 在人外周血單核細(xì)胞上表達(dá)，并且還可以不依賴LPS 誘導(dǎo)途徑直接與人巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞相互作用[9]。此外，Boylan等[10]通過iTRAQ?定量蛋白質(zhì)組分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)，人卵巢癌中LBP 蛋白表達(dá)量是正常人LBP 蛋白表達(dá)量的2 倍左右。隨后發(fā)現(xiàn)LBP 在多種癌組織中過表達(dá)，并且與癌癥的發(fā)展息息相關(guān)[11?13]。然而，LBP在OSCC中的作用卻鮮有研究。

CD204 亦稱巨噬細(xì)胞清道夫受體A（macroph?age scavenger receptor A，MSR?A），是巨噬細(xì)胞表達(dá)的主要受體之一[14]，主要調(diào)控巨噬細(xì)胞替代性活化。并且大量研究表明，CD204 與包括OSCC在內(nèi)的多種癌癥關(guān)系密切[15?18]。鑒于此，將LBP與CD204 進(jìn)行免疫組織化學(xué)雙染實(shí)驗(yàn)，可以初步探索LBP 與巨噬細(xì)胞的基本關(guān)系并為以后研究LBP與OSCC的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

本研究中，筆者通過對(duì)LBP、CD204 蛋白進(jìn)行免疫組織化學(xué)雙染實(shí)驗(yàn)以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)以檢測LBP 在OSCC 患者癌組織和血清中的表達(dá)情況。同時(shí)，本研究也對(duì)LBP 與OSCC 的臨床病理特征作了相關(guān)性分析，以探究LBP 在OSCC 中的表達(dá)及其潛在的意義。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

本研究選擇2018 年1 月—2020 年4 月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院診治的178名成年OSCC患者和90 名正常人。OSCC 患者納入標(biāo)準(zhǔn)為臨床病理診斷為原發(fā)性O(shè)SCC，并且術(shù)前未行放療和化療。其中選取48 名OSCC 患者，于手術(shù)過程中采集癌組織及相對(duì)應(yīng)癌旁組織（距離癌組織＞3 cm）標(biāo)本，立即行4%多聚甲醛固定；選取130 名OSCC患者和90 名正常人分別于術(shù)前空腹及空腹?fàn)顟B(tài)下抽取3 mL 外周靜脈血，注入促凝管中靜置1 h 后，4 ℃離心10 min（3 000 r·min?1），吸取血清并分裝置于?80 ℃中保存。收集患者的臨床病理資料主要包括腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和病理分級(jí)等。所有標(biāo)本的收集及使用均經(jīng)受試者同意并簽署知情同意書，本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

DS?0001 免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉金橋公司），DY870?05 試劑盒（R&D Systems 中國公司）。兔抗人LBP 抗體（HPA001508，中國Sigma?Aldrich公司），工作質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1∶100；鼠抗人CD204 抗體（Clone No. SRA?E5，Transgenic公司，美國），工作質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1∶200。

1.3 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)的主要步驟如下：厚度為3 μm 的組織切片分別經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫蠟和水化，高溫高壓下檸檬酸鈉緩沖液抗原修復(fù)后進(jìn)行內(nèi)源性酶阻斷劑和山羊血清封閉，LBP 和CD204 混合一抗4 ℃孵育過夜，復(fù)溫后行混合二抗孵育，DAB 和GBI 顯色，Mayer’s 蘇木素復(fù)染，封片等。未添加一抗組設(shè)為陰性對(duì)照組。每次實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。所有切片均經(jīng)400倍放大觀察并選取10個(gè)具有代表性的視野進(jìn)行拍片，由3名病理醫(yī)生結(jié)合巨噬細(xì)胞陽性染色的強(qiáng)度和所占百分比進(jìn)行評(píng)分。巨噬細(xì)胞陽性染色強(qiáng)度記分的標(biāo)準(zhǔn)如下。0：無染色；1：輕度染色；2：中度染色；3：重度染色。陽性細(xì)胞所占百分比記分的標(biāo)準(zhǔn)如下。0：陰性；1：1%～25%陽性細(xì)胞；2：25%～50%陽性細(xì)胞；3：50%～75%陽性細(xì)胞；4：75%～100%陽性細(xì)胞。最后計(jì)算兩種記分的乘積求得平均值[19]。此平均值＞0者為陽性，反之為陰性。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

血清樣本稀釋度為1∶100，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照DY870?05 試劑盒說明書進(jìn)行，其主要步驟如下。首先將捕獲抗體包被在酶標(biāo)板上，室溫孵育過夜，次日封閉液封閉1 h，隨后依次加入標(biāo)準(zhǔn)品或血清樣本及檢測抗體各室溫孵育2 h，接著先后加入辣根過氧化物標(biāo)記酶和底物溶液顯色，各室溫避光孵育15 min，最后加入終止溶液終止顯色，用酶標(biāo)儀分別在450 nm 和540 nm（校正波長）下測定光密度值（optical density，OD），進(jìn)而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本的LBP 血清質(zhì)量濃度。每次實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布者用χˉ±SD 表示，選擇獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素ANOVA 分析比較LBP 或CD204 表達(dá)水平與不同分組之間的關(guān)系，反之用M（Q1?Q3）表示，選擇Mann?Whitney或Kruskal?Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行比較。采用Medcalc 繪制ROC 曲線分析LBP 血清濃度在OSCC 診斷的應(yīng)用價(jià)值，利用You?den 指數(shù)確定LBP 血清質(zhì)量濃度最佳臨界值并計(jì)算相應(yīng)的特異性和靈敏度。ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）采用Z檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LBP在OSCC組織中過表達(dá)

免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)本信息見表1。LBP主要表達(dá)在OSCC 中的間質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)或胞膜上，呈紅色染色；CD204 主要表達(dá)在OSCC 中的巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)或胞膜上，呈黃褐色染色。CD204 和LBP 共表達(dá)在巨噬細(xì)胞中則呈現(xiàn)暗紅色染色，說明LBP 表達(dá)在巨噬細(xì)胞中。雙染結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和癌旁組織相比，OSCC 組織中的LBP 表現(xiàn)出更強(qiáng)的染色強(qiáng)度和更廣的染色范圍。本實(shí)驗(yàn)對(duì)雙染結(jié)果進(jìn)行半定量分析，發(fā)現(xiàn)癌組織中的免疫組織化學(xué)評(píng)分明顯比癌旁組織的高（P＜0.001），提示LBP可能是OSCC 的檢測標(biāo)志物。同時(shí)CD204 在OSCC 組織中過表達(dá)（圖1）。另外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，LBP 主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞中，這提示LBP 可能通過與巨噬細(xì)胞相互作用從而對(duì)OSCC 產(chǎn)生影響。

表1 LBP的表達(dá)與OSCC患者臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系Tab 1 Association between the patient’s clinicopathological characteristics and LBP expression in OSCC patients

2.2 LBP 與OSCC 患者的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期相關(guān)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)OSCC 的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期和臨床分期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)在不同腫瘤分期的癌組織中，LBP 表達(dá)水平有明顯差異（P=0.007）。同時(shí)，臨床分期越高，LBP 表達(dá)量也越大（P=0.007）（圖2）。

與淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者的LBP 表達(dá)水平相比，淋巴結(jié)已轉(zhuǎn)移患者的LBP 表達(dá)水平顯著升高（P=0.039）（圖3）。

此外，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)CD204 與OSCC 患者的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期明顯關(guān)聯(lián)（P＜0.05）。然而，本實(shí)驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)LBP 或CD204 與OSCC 的病理分級(jí)有關(guān)（P＞0.05），其與患者的年齡、性別亦不相關(guān)（圖3）。

圖1 LBP和CD204在OSCC組織中過表達(dá)Fig 1 The overregulated expression of the LBP and CD204 protein in the OSCC tissues

圖2 LBP和CD204在不同的腫瘤分期以及臨床分期OSCC中的表達(dá)Fig 2 The LBP and CD204 protein expression in different T?classification and clinical stage of OSCC

圖3 LBP和CD204在不同的病理分級(jí)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移OSCC中的表達(dá)Fig 3 The LBP and CD204 protein expression in different histological grade and node lymph metastasis of OSCC

從這些結(jié)果可以預(yù)測，LBP 與OSCC 的發(fā)生發(fā)展以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

2.3 LBP在OSCC患者血清中的表達(dá)

由于前期研究發(fā)現(xiàn)，LBP 與OSCC 有相關(guān)性，本研究則進(jìn)一步檢測了LBP 在OSCC 患者血清中的表達(dá)情況。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的標(biāo)本信息見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常人LBP 血清質(zhì)量濃度為1.02 μg·mL?1（0.81～1.10 μg·mL?1），OSCC 患者的LBP 血清質(zhì)量濃度為1.59 μg·mL?1（1.31～2.03 μg·mL?1）。與正常人比較，OSCC患者的LBP血清質(zhì)量濃度明顯升高（P＜0.001）。并且本實(shí)驗(yàn)對(duì)OSCC 患者的臨床病理特點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)LBP 血清質(zhì)量濃度與其臨床分期（P＜0.001）和腫瘤分期（P＜0.001）相關(guān)。然而，OSCC患者的年齡、性別、病理分級(jí)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與LBP 血清質(zhì)量濃度之間未出現(xiàn)相關(guān)性（圖4）。此結(jié)果與免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本保持一致。

2.4 LBP血清質(zhì)量濃度在OSCC診斷中的價(jià)值

本實(shí)驗(yàn)通過繪制ROC 曲線分析血清中LBP 質(zhì)量濃度在OSCC診斷中的價(jià)值。其中AUC為0.876（95%CI，0.825～0.917；Z=15.614；P＜0.001），LBP血清質(zhì)量濃度的最佳截?cái)嘀禐?.733 μg·mL?1，此時(shí)的特異性為93.3%，敏感性為80.0%（圖5）。這提示，LBP 血清質(zhì)量濃度可以作為有效的OSCC診斷輔助指標(biāo)之一。

表2 LBP血清濃度與OSCC患者臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系Tab 2 Association between the patient’s clinicopathological characteristics and LBP serum level in OSCC patients

圖4 LBP在OSCC患者以及正常人組的血清質(zhì)量濃度Fig 4 The increased serum level of LBP in OSCC patients

圖5 OSCC組與正常人組ROC曲線Fig 5 ROC curve for OSCC patients vs.normal group

3 討論

本研究首次提出LBP 在人OSCC 中高表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)LBP 與OSCC 的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期有關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)其與OSCC 患者的性別、年齡以及病理分級(jí)相關(guān)。并且通過ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)LBP 血清質(zhì)量濃度在OSCC 診斷中具有重要價(jià)值。

大量研究表明，LBP 在促進(jìn)癌癥發(fā)展方面可能發(fā)揮重要作用。例如，Boylan等[10]發(fā)現(xiàn)人卵巢癌LBP 蛋白表達(dá)量明顯比正常人高。在人結(jié)腸癌中也檢測到LBP 基因異常表達(dá)[20?21]。而且，LBP 也被報(bào)道有助于癌癥的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后。Kovacs等[11]發(fā)現(xiàn)無論是基因水平還是蛋白水平，LBP 在傳統(tǒng)性腎細(xì)胞癌中都顯著高表達(dá)，并且隨著臨床分期和病理分級(jí)的增加而增高，這對(duì)于傳統(tǒng)性腎細(xì)胞癌的發(fā)生和不良預(yù)后作用突出。在肝細(xì)胞癌中也能觀察到類似現(xiàn)象，而且與LBP 低表達(dá)組相比，LBP 高表達(dá)組的平均總生存期相對(duì)減少17 個(gè)月，平均復(fù)發(fā)時(shí)間相對(duì)提前13.1 個(gè)月[22]。同時(shí)，人血清中LBP 的質(zhì)量濃度與非小細(xì)胞肺癌呈正相關(guān)，轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者血清中LBP表達(dá)水平也遠(yuǎn)高于非轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者[13]。

CD204 主要在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中表達(dá)，在多種癌癥中有廣泛研究，被認(rèn)為是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分子標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)中表達(dá)CD204 的巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)黃褐色染色，在不同的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期OSCC 中，CD204 表達(dá)存在明顯差異，表明CD204 與OSCC 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，這與以往的報(bào)道相一致[23]。

已有研究報(bào)道，LBP 在巨噬細(xì)胞上有表達(dá)[9]，本研究通過免疫組織化學(xué)雙染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)共表達(dá)在同一細(xì)胞的LBP 和CD204 兩者染色相互疊加顯現(xiàn)新的染色，并且此種細(xì)胞主要浸潤在腫瘤組織間質(zhì)中，從而證實(shí)了LBP 表達(dá)在OSCC 的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞上。體外實(shí)驗(yàn)表明，LPS 刺激與單核細(xì)胞共培養(yǎng)的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞，可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞分泌腫瘤促進(jìn)因子包括CD14、白細(xì)胞介素?6 和一氧化氮等，這個(gè)過程可以增強(qiáng)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系的生長和侵襲[24?25]。進(jìn)而推測，LBP可能參與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互作用，促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有研究報(bào)道，正常人血清中LBP 質(zhì)量濃度保持在0.5 μg·mL?1以下[5]。本實(shí)驗(yàn)中OSCC 患者的LBP 血清質(zhì)量濃度明顯高于正常人血清中LBP 質(zhì)量濃度，并且血清中LBP 質(zhì)量濃度的最佳臨界值為0.733 μg·mL?1，可以作為有效的OSCC輔助性診斷指標(biāo)之一。筆者初步發(fā)現(xiàn)，LBP在OSCC 中異常表達(dá)，并與腫瘤的臨床分期等有關(guān)，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能起到正向作用。未來有必要深入研究LBP 在調(diào)控OSCC 的發(fā)生發(fā)展過程中潛在的分子機(jī)制。

總之，無論是在OSCC 癌組織或者血清中，LBP 表達(dá)水平明顯上調(diào)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，提示LBP在OSCC的診斷中具有潛在的臨床價(jià)值。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。