李帆 張利娟 譚凱璇 張穎 盧潔 李姍姍 楊芳

1.青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 青島266003；2.青島市市立醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心 青島266071；3.大連醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 大連116044

氯己定（chlorhexidine，CHX）具有相當(dāng)強的廣譜抑菌、殺菌效果，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌以及真菌均有效[1]。CHX 作為漱口水和根管沖洗液的添加成分，其效果較為確切[2]。臨床常用CHX 的藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%～2%。白色念珠菌，是口腔中最常分離到的條件致病真菌之一[3]，是口腔真菌感染中最常見的真菌種類[4]，也是持續(xù)性根管感染、難治性根尖周炎及根管治療失敗患者最常分離到的真菌種類[5]。

最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentra?tion，MIC）是定量評價藥物抑菌效能的金標(biāo)準(zhǔn)和重要指標(biāo)[6]，但在該濃度下，微生物生長雖受到抑制，細(xì)胞代謝的抑制情況卻不清楚。重水標(biāo)記的單細(xì)胞拉曼顯微光譜技術(shù)，是重水標(biāo)記技術(shù)和拉曼技術(shù)的結(jié)合。重水可以使有代謝活性微生物的拉曼圖譜中特定區(qū)域（2 040～2 300 cm?1）出現(xiàn)重水峰（C?D 峰），基于ΔC?D ratio ［（當(dāng)前時間與0 h 的C?D ratio（重水峰所占比例）差值］測定的最小代謝活性抑制濃度（minimum inhibitory con?centration based on metabolic activity，MIC?MA）[7?8]能定量評價藥物對微生物實時代謝活性的影響[8]。該技術(shù)已普遍應(yīng)用于微生物種類鑒別的研究[7]，也曾廣泛用于評價藥物對細(xì)菌代謝活性的影響[8]，但有關(guān)藥物對真菌代謝活性影響的相關(guān)文獻(xiàn)及研究還非常少見。

系統(tǒng)了解CHX 對白色念珠菌生長及代謝活性的影響有利于全面了解白色念珠菌的藥敏性，指導(dǎo)臨床合理使用藥物，減少耐藥菌株的產(chǎn)生及疾病反復(fù)感染和治療失敗的發(fā)生概率。本研究采用肉湯稀釋法和重水拉曼技術(shù)，研究重水對白色念珠菌生長的影響及該菌對重水的吸收規(guī)律，以評價重水拉曼技術(shù)的普適性；同時測定CHX 對白色念珠菌的MIC 和MIC?MA，評價CHX 對白色念珠菌生長及代謝的抑制效果。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與菌株培養(yǎng)

實驗材料：實驗用標(biāo)準(zhǔn)菌株白色念珠菌CICC32380 購自中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心；SDA 固體培養(yǎng)基，以蛋白胨10 g、瓊脂20 g、葡萄糖40 g加蒸餾水定容至1 L，115 ℃下高溫滅菌20 min，趁熱倒入培養(yǎng)皿，凝固后備用；RPMI1640培養(yǎng)基用無菌雙蒸水溶解，每1 L 加入2 g NaHCO3，用HCl 和NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 為7.0，過膜濾菌，備用；質(zhì)量分?jǐn)?shù)19%～21%CHX，購自青島漢爵生物技術(shù)有限公司。

實驗菌株的培養(yǎng)：將白色念珠菌CICC32380劃線接種到Y(jié)PD 固體培養(yǎng)基，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，取白色念珠菌菌落，轉(zhuǎn)種到RPMI1640液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min?1搖床中培養(yǎng)12 h，備用。

1.2 重水拉曼技術(shù)普適性評價

1.2.1 重水環(huán)境對白色念珠菌生長的影響 與其他同位素標(biāo)記物相比，重水價格便宜，對微生物干擾小[7]；但也有研究[9?10]表明，重水可能抑制細(xì)胞的活動，本實驗在重水環(huán)境中培養(yǎng)白色念珠菌，觀察對其生長的影響。將實驗菌株接種于含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0%、10%、20%、30%、40%、50%）重水的培養(yǎng)基中（0%為對照組）培養(yǎng)9 h，利用分光光度計（上海屹譜儀器制造有限公司）測定白色念珠菌吸光度值OD600隨時間的變化，檢測不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)重水對其生長的影響。

1.2.2 白色念珠菌對重水的吸收規(guī)律 另取上述接種于不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)重水中的實驗菌株培養(yǎng)12 h，于不同時間點（0、1、2、3、4、6、8、12 h）分別取樣進(jìn)行拉曼技術(shù)檢測，以評價該菌株對重水的吸收規(guī)律。

1.3 采用肉湯稀釋法測定CHX 對白色念珠菌的MIC

取YPD 固體培養(yǎng)基上生長24 h 的菌落，置于5 mL 無菌水中，渦旋15 s；調(diào)整菌密度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)，稀釋1 000 倍，最終菌密度為每毫升1 000～5 000 個細(xì)胞。實驗設(shè)置空白對照組：只含培養(yǎng)基，以排除培養(yǎng)基污染的可能性；陰性對照組：含有培養(yǎng)基+實驗菌，以證明實驗菌株可以在培養(yǎng)基中生長良好；實驗組：含有培養(yǎng)基+實驗菌+不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CHX。實驗組中，通過調(diào)整培養(yǎng)基和CHX 配比，使CHX 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最終為32、16、8、4、2、1 μg·mL?1。37 ℃溫度下培育24 h，利用分光光度計分別測量0 h 和24 h 的OD600值，計算ΔOD600（0 h 和24 h 的OD600吸光度值的差值），ΔOD600≤0.05對應(yīng)的最低藥物濃度，即CHX對白色念珠菌的MIC[11]。

1.4 采用重水拉曼技術(shù)測定CHX 對白色念珠菌的MIC?MA

將實驗菌株接種至含0、2、4、8、12 μg·mL?1CHX的RPMI1640培養(yǎng)基（含30%重水）中，37 ℃培養(yǎng)8 h，按時間梯度取樣，每個時間點取0.2μL測量樣品點在CaF2玻片上，風(fēng)干。利用LabRam HR 型的改良后共聚焦拉曼熒光顯微鏡（Shelab 公司，美國）采集拉曼圖譜（參數(shù)設(shè)定如下：激光源為532 nm 的Nd:YAG 激光，樣品上激光強度為50 mW，照射時間1 s，分光光柵300 grooves·mm?1，拉曼圖譜范圍400～3 500 cm?1），在不同視野中隨機采集30～50 個細(xì)胞的拉曼圖譜。圖譜經(jīng)過減背景、基線歸一化和最大值標(biāo)準(zhǔn)化處理，即可計算出C?D ratio值。計算ΔC?D ratio（培養(yǎng)8 h與0 h的C?D ratio 差值），當(dāng)ΔC?D ratio≤0 且標(biāo)準(zhǔn)差＜0.005即為CHX對白色念珠菌的MIC?MA[8]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

本實驗中定量實驗數(shù)據(jù)采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，統(tǒng)計方法采用T檢驗，檢驗水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 重水拉曼技術(shù)普適性評價

2.1.1 重水環(huán)境對白色念珠菌生長的影響 白色念珠菌在含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)重水環(huán)境下的生長狀態(tài)見圖1。生理狀態(tài)下，白色念珠菌的生長過程包括延遲期（0～2 h）、對數(shù)期（2～8 h）、穩(wěn)定期（8～9 h）；與對照組相比，白色念珠菌在10%～30%重水中生長沒有受到明顯抑制（P＞0.05）；在40%～50%重水中，生長則受到明顯抑制（P＜0.05）。該結(jié)果提示，白色念珠菌能夠耐受30%的重水，重水的毒性并不是本實驗的限制性因素。

2.1.2 白色念珠菌對重水的吸收規(guī)律 白色念珠菌在含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)重水環(huán)境中培養(yǎng)12 h，在不同時間點進(jìn)行拉曼檢測的結(jié)果見圖2 和圖3。與對照組相比，10%重水環(huán)境下，即出現(xiàn)C?D 峰（圖2）；且C?D ratio 與重水質(zhì)量分?jǐn)?shù)成正相關(guān)關(guān)系（R2=0.989 4，P＜0.05；圖3）。該結(jié)果表明，實驗菌株能活躍代謝重水并通過拉曼圖譜檢測到，因此本研究選擇不影響實驗菌株生長又能產(chǎn)生明顯C?D 峰的重水質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即30%重水作為后續(xù)實驗的默認(rèn)重水質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖1 白色念珠菌CICC32380在含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)重水中OD600隨時間的變化Fig 1 Temporal change of OD600 for Candida albicans CICC32380 under various quality score D2O

圖2 含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)重水環(huán)境下白色念珠菌CICC32380 的單細(xì)胞拉曼圖譜變化Fig 2 Change of single cell Raman spectrum for Candida albicans CICC32380 under various quality score D2O

白色念珠菌在30%重水環(huán)境中，其C?D ratio及OD600隨時間的變化趨勢見圖4和圖5。C?D峰在加入重水后迅速出現(xiàn)并快速升高，1 h 即有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001），而吸光度值OD600在2 h 才發(fā)生明顯升高，其變化晚于C?D ratio變化曲線至少1 h。基于上述實驗結(jié)果可見，拉曼圖譜技術(shù)用于評價藥物對真菌代謝活性的影響時，敏感性更高且省時。

2.2 CHX對白色念珠菌的MIC測定結(jié)果

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)CHX 對白色念珠菌的MIC 測定結(jié)果見表1，ΔOD600≤0.05 對應(yīng)的最低藥物濃度，即CHX 對白色念珠菌的MIC?？瞻讓φ战M在培養(yǎng)0 h 與24 h 的吸光度差值（ΔOD600）未發(fā)生明顯變化，可以排除培養(yǎng)基污染的可能。陰性對照組OD600的變化明顯，表明實驗菌株活力良好。CHX質(zhì)量濃度分別為1、2μg·mL?1時，ΔOD600＞0.05；而當(dāng)CHX 質(zhì)量濃度為4、8、16、32μg·mL?1時，ΔOD600≤0.05。由此可見，CHX 對白色念珠菌的MIC為4 μg·mL?1。

圖3 穩(wěn)定期白色念珠菌CICC32380 單細(xì)胞拉曼圖譜中C?D ratio與重水質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間呈線性關(guān)系Fig 3 There was a linear relationship between the C?D ratio of Candida albicans CICC32380 at stable stage and D2O concentra?tion followed by single cell Raman spectrum measurement

圖4 30%重水環(huán)境下白色念珠菌CICC32380 隨時間變化的單細(xì)胞拉曼圖譜Fig 4 Temporal change of single cell Raman spectrum for Candida albicans CICC32380 under 30%D2O

2.3 CHX對白色念珠菌MIC?MA的測定

CHX 對白色念珠菌的MIC?MA 測定結(jié)果見表2 和圖6。與陰性對照組相比，CHX 在0.5×MIC（2 μg·mL?1）及MIC（4 μg·mL?1）時，ΔC?D?ratio＞0且未見明顯降低（P＞0.05）；在2×MIC 及3×MIC（8 μg·mL?1及12 μg·mL?1）時，ΔC?D?ratio＜0 且標(biāo)準(zhǔn)差＜0.005，ΔC?D ratio 值明顯降低（P＜0.001）。由此可見，CHX 對白色念珠菌的MIC?MA 為8 μg·mL?1，即2×MIC。當(dāng)CHX≤4 μg·mL?1，C?D ratio 隨時間的變化趨勢與陰性對照組無明顯差異（P＞0.05），而CHX＞4 μg·mL?1，C?D ratio 在8 h 內(nèi)甚至24 h 內(nèi)均維持在基線水平（圖7），說明該質(zhì)量濃度下，藥物作用發(fā)揮迅速，實驗菌株的代謝活動瞬時即可受到完全的抑制，并在一定時間內(nèi)未見恢復(fù)代謝活性。

圖5 30%重水環(huán)境下白色念珠菌CICC32380 C?D ratio 曲線和生長曲線隨時間的變化Fig 5 Temporal change of C?D ratio curve and growth curve of Candida albicans CICC32380 under 30%D2O

表1 CHX對白色念珠菌CICC32380的MIC測定結(jié)果Tab 1 Measurement of MIC for Candida albicans CICC32380 under CHX

表2 CHX對白色念珠菌CICC32380的MIC-MA測定結(jié)果Tab 2 Measurement of MIC-MA for Candida albicans CICC32380 under CHX

圖6 CHX對白色念珠菌CICC32380的MIC?MA測量Fig 6 Measurement of MIC?MA under CHX for Candida albicans CICC32380

圖7 C?D ratio在不同質(zhì)量濃度CHX作用下的時間曲線Fig 7 Temporal dynamics of the C?D ratio under various quality score CHX

3 討論

本研究確定了CHX 對白色念珠菌的MIC 及MIC?MA，通過探討CHX 對微生物生長及代謝的影響，系統(tǒng)地評價了CHX 對白色念珠菌的抑菌效能；同時，本研究建立了藥物對真菌代謝活性的作用模型，為后期評價口腔常見藥物對微生物抑菌效能研究提供了參考依據(jù)。

CHX 對白色念珠菌生長的抑制效果已有諸多報道[12?13]。Ferguson等[12]報道，CHX 對白色念珠菌的MIC＜0.63 μg·mL?1；Estrela等[13]則 發(fā) 現(xiàn)MIC 為0.2 μg·mL?1。本實驗探索的MIC 與以往報道有所差別，分析原因可能是在實驗菌株培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的亞種、培養(yǎng)基組成、儀器設(shè)備及實驗者操作等多種差異造成的。

在以往的研究中，評價藥物對微生物的抑菌效能均是基于肉湯稀釋法，參考MIC 指標(biāo)僅考慮其對微生物生長的抑制效能，耗時且不能評價不生長但有代謝活性（nongrowing but metabolically active，NGMA）細(xì)胞[14]的抑菌效能。本實驗顯示，菌株在MIC 下生長受到抑制，但仍具有很高的代謝活性，與前期相關(guān)研究[8]中CHX 對變異鏈球菌、血鏈球菌、發(fā)酵乳桿菌等細(xì)菌代謝活性影響的研究結(jié)果相似。在基于重水拉曼技術(shù)的MIC?MA 下，白色念珠菌的生長不僅受到完全抑制，代謝活性也瞬時受到完全抑制，并且在一定時間內(nèi)，未見代謝活性的恢復(fù)。本研究通過重水拉曼技術(shù)發(fā)現(xiàn)了真菌的NGMA 細(xì)胞，此種細(xì)胞可能是疾病反復(fù)感染甚至治療失敗的重要原因[15]。

以往多采用二甲氧唑磺比色法檢測細(xì)胞代謝活性，然而該方法存在溶液的不穩(wěn)定性、培養(yǎng)體系中過氧化物及某些代謝產(chǎn)物影響結(jié)果準(zhǔn)確性等因素，從而限制了該方法的應(yīng)用[16]。重水標(biāo)記的單細(xì)胞拉曼顯微光譜技術(shù)，能夠在不改變細(xì)胞組分、不依賴細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，減少對細(xì)胞的損傷及人為干擾因素，達(dá)到在單細(xì)胞的水平快速、定量、無損地評價藥物對微生物實時代謝活性的影響[7?8,17]。同時，通過該技術(shù)測得的拉曼圖譜包含的信息相當(dāng)豐富，可以反映出物質(zhì)的生化及結(jié)構(gòu)特性，理論上能夠覆蓋細(xì)胞內(nèi)所有物質(zhì)的圖譜，特別是600～1 800 cm?1范圍的“指紋區(qū)”[18]，可以區(qū)分細(xì)胞類型、探討微生物應(yīng)激機制等，具有相當(dāng)廣闊的應(yīng)用前景及重要的指導(dǎo)意義。

CHX 是一種帶正電荷的親水親脂分子，可與帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞壁之間的靜電相結(jié)合，導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白的沉淀和凝固，同時也可導(dǎo)致細(xì)胞膜的完整性發(fā)生改變，使低相對分子質(zhì)量的胞內(nèi)成分發(fā)生滲漏，影響細(xì)胞的生長及代謝活動。CHX 作為口腔常用藥物，具有低細(xì)胞毒性的特點；但CHX 在使用過程中仍可能導(dǎo)致過敏反應(yīng)，舌、義齒、牙齒著色以及味覺改變等不良反應(yīng)，其發(fā)生概率隨質(zhì)量濃度的增高而增大[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，CHX 對白色念珠菌的MIC 和MIC?MA，遠(yuǎn)低于臨床常用濃度（0.12%～2%，即1.2～20 g·L?1）。該結(jié)果提示，盡管在臨床使用過程中，CHX 可能被稀釋，但對白色念珠菌的生長及代謝仍具有很好的抑制作用，甚至稀釋近千倍仍然具有良好的效果。

本研究采用重水標(biāo)記的單細(xì)胞拉曼顯微光譜技術(shù)探討真菌藥敏性和CHX 對白色念珠菌代謝的影響，技術(shù)手段先進(jìn)。本實驗建立了藥物對真菌代謝活性影響的模型，為后期評價口腔常見藥物對微生物抑菌效能的研究提供了參考，可以指導(dǎo)臨床快速篩選藥物，達(dá)到盡快篩選出高效低毒、安全有效且不易產(chǎn)生耐藥菌的目的。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。