樊智雅, 秦偉捷

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所,北京蛋白質(zhì)組研究中心,國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心(北京),蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206)

核糖核酸(RNA)是細(xì)胞基因組轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物,根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同可分為編碼蛋白質(zhì)的信使RNA(mRNA)和非編碼RNA(ncRNA),RNA參與很多重要的生命活動(dòng),是細(xì)胞中必不可少的一類生物大分子。RNA在細(xì)胞中并非單獨(dú)存在,從它們產(chǎn)生到被降解的過(guò)程中與大量蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用,在真核細(xì)胞中存在上千種RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs)與RNAs結(jié)合形成種類紛繁復(fù)雜的RNA-蛋白復(fù)合物(RP復(fù)合物),并以這種復(fù)合物的形式發(fā)揮生理功能。以mRNAs為例,pre-mRNAs被轉(zhuǎn)錄合成后經(jīng)過(guò)5′端加帽、剪接、多聚腺苷酸化到成熟,再經(jīng)過(guò)出核、定位和翻譯到最終被降解,mRNAs的整個(gè)生命周期都依賴著多種mRBPs與之結(jié)合才能發(fā)揮作用[1]。同時(shí),非編碼RNA也在RBPs的參與下介導(dǎo)組蛋白修飾和基因調(diào)控過(guò)程[2]。

這些功能實(shí)現(xiàn)的前提是RP復(fù)合物的正確組裝,RNAs或RBPs任一組分的異常與缺失都會(huì)影響RNAs的正常功能,從而影響基因表達(dá)[3],RBPs還有可能通過(guò)干擾癌細(xì)胞能量代謝使癌癥惡化[4]。這些都會(huì)導(dǎo)致生理過(guò)程紊亂和疾病的發(fā)生,包括代謝異常、肌肉萎縮癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病和癌癥[5-7]。例如,RBP HuR(human antigen R)的過(guò)表達(dá)能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)信號(hào)通路,使癌細(xì)胞適應(yīng)惡劣的腫瘤微環(huán)境,促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。在體外使用siHuR或小分子抑制劑選擇性拮抗HuR或HuR-RNA相互作用能顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)。因此,定性定量分析RBPs的表達(dá)譜及其在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中與RNAs靶標(biāo)之間的復(fù)雜相互作用網(wǎng)絡(luò)有助于挖掘RP復(fù)合物在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,并為開發(fā)腫瘤生物標(biāo)志物和治療方式提供了新的思路。

目前研究者們已經(jīng)不再滿足于研究單個(gè)RP復(fù)合物的功能,在組學(xué)層面上研究和理解RNAs與RBPs的相互作用是必然趨勢(shì)。生物質(zhì)譜具有靈敏度高、動(dòng)態(tài)范圍寬、通量大的特點(diǎn),是組學(xué)研究的必要分析手段。但由于RNAs與RBPs相互作用的動(dòng)態(tài)性和網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性,全面系統(tǒng)的闡述RP復(fù)合物的組成及動(dòng)態(tài)變化并非易事。而作為系統(tǒng)性解析RP復(fù)合物組成、含量和功能的第一步,大規(guī)模富集RP復(fù)合物極具挑戰(zhàn)性。為了解決這一難題,研究者們發(fā)展了各種富集鑒定策略,本文針對(duì)RP復(fù)合物富集策略的最新進(jìn)展進(jìn)行了綜述,比較分析了它們的技術(shù)原理、優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用,并提出了需要解決的技術(shù)挑戰(zhàn),為富集策略的發(fā)展提供新的思路。

1 RP復(fù)合物富集策略

早期在富集RP復(fù)合物時(shí)通常利用RBPs與RNAs之間保持天然結(jié)合的特性在體外條件下實(shí)現(xiàn)富集,然而利用非內(nèi)源性RNA和蛋白質(zhì),在非體內(nèi)環(huán)境的結(jié)合會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)程度的假陽(yáng)性結(jié)果,高洗滌強(qiáng)度也會(huì)導(dǎo)致RP復(fù)合物中結(jié)合力低的組分丟失。而體內(nèi)條件下形成的RP復(fù)合物比通過(guò)體外方法獲得的RP復(fù)合物更具有生物學(xué)相關(guān)性,能更真實(shí)地反映體內(nèi)RNA-蛋白質(zhì)相互作用的生理狀態(tài),近年最新發(fā)展的富集策略主要是在體內(nèi)環(huán)境下實(shí)現(xiàn)RP復(fù)合物的富集。同樣,為了克服因洗脫造成的部分RP復(fù)合物丟失的難題,需要增強(qiáng)核酸與蛋白質(zhì)的相互作用。最簡(jiǎn)單有效的方法就是進(jìn)行交聯(lián)(cross-linking),主要分為化學(xué)交聯(lián)和紫外光(UV)交聯(lián)?；瘜W(xué)交聯(lián)通常采用甲醛試劑----一種雙功能交聯(lián)劑,可輕易滲透細(xì)胞并在0.2 nm以內(nèi)的大分子之間形成可逆的共價(jià)鍵,因而會(huì)形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物干擾RP復(fù)合物的鑒定。紫外光交聯(lián)則是在RP復(fù)合物研究中應(yīng)用更為廣泛的“零距離”交聯(lián)方式,UV可特異性地引發(fā)蛋白質(zhì)與RNA之間形成不可逆的共價(jià)交聯(lián),從而排除在甲醛交聯(lián)中不可避免的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交聯(lián),降低結(jié)果的假陽(yáng)性。UV交聯(lián)無(wú)疑成為體內(nèi)研究RP復(fù)合物的基礎(chǔ),圍繞UV交聯(lián)誕生了許多經(jīng)典的研究策略,下面將詳細(xì)闡述。

1.1 UV交聯(lián)和免疫沉淀及衍生技術(shù)

2003年Darnell等[8]提出了一種用于RP復(fù)合物富集的UV交聯(lián)和免疫沉淀(crosslinking and immunoprecipitation,CLIP)策略,其目的是捕獲并檢測(cè)與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的RNA片段,他們使用CLIP策略聯(lián)合Sanger測(cè)序鑒定到了340個(gè)與小鼠腦中剪接因子Nova1、Nova2相互作用的RNA序列。隨后,Darnell團(tuán)隊(duì)又對(duì)細(xì)節(jié)進(jìn)行了優(yōu)化[9],CLIP的技術(shù)路線是:首先通過(guò)UV(254 nm)照射使RBP與RNA共價(jià)交聯(lián),然后使用RNA酶(RNase)溫和酶切,與RBP結(jié)合的RNA會(huì)因RBP的保護(hù)而留下一定長(zhǎng)度的片段,再將RNA片段的3′-磷酸基團(tuán)進(jìn)行去磷酸化,防止RNA片段的環(huán)化自連接,而RNA片段的5′末端將進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記(32P標(biāo)記),接著用修飾有目標(biāo)蛋白質(zhì)抗體的微球/磁珠將目標(biāo)RBP蛋白及RNA片段富集下來(lái),再使用蛋白酶K將蛋白質(zhì)降解,得到的RNA片段將采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)擴(kuò)增,最后進(jìn)行測(cè)序分析就可以得到目標(biāo)RBP結(jié)合RNA的種類以及結(jié)合的位點(diǎn)信息,具體流程如圖1。

圖 1 CLIP技術(shù)鑒定RNAs蛋白結(jié)合位點(diǎn)示意圖Fig. 1 A schematic representation of CLIP for identification of protein binding sites on RNAs

CLIP技術(shù)一經(jīng)提出就獲得了高度關(guān)注,但是該方法也面臨著通量低、UV存在偏好性、穿透力弱、交聯(lián)效率低(大約僅為1%～5%)等問(wèn)題。盡管可以通過(guò)對(duì)組織樣品低溫研磨和不斷混合使UV更高效地穿透細(xì)胞促進(jìn)樣品的均勻交聯(lián),但高能量UV長(zhǎng)時(shí)間照射可能會(huì)導(dǎo)致RNA的降解[10]。在此基礎(chǔ)上,越來(lái)越多的研究者投入研究并不斷改進(jìn),產(chǎn)生了許多各具特色的衍生CLIP技術(shù)。

為了提高交聯(lián)效率,Hafner等[11]發(fā)展了一種光活化核苷增強(qiáng)的CLIP策略(photoactivatable-ribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation,PAR-CLIP)。他們將光活性更強(qiáng)的核苷代謝進(jìn)入RNA,可以使RNA和蛋白質(zhì)在更長(zhǎng)波長(zhǎng)的UV(如365 nm)照射下交聯(lián)。具有代表性的核苷有4-硫代尿苷(4-thiouridine,4SU)和6-硫代鳥苷(6-thioguanosine,6SG),4SU比6SG的交聯(lián)效率更高。與常規(guī)的254 nm UV交聯(lián)相比,PAR-CLIP可將交聯(lián)效率提高100到1 000倍。此外,PAR-CLIP的另一項(xiàng)優(yōu)勢(shì)是,4SU與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)后,該位點(diǎn)在逆轉(zhuǎn)錄時(shí)受到非交聯(lián)寡核糖核苷酸背景的影響,多達(dá)70%的RNA序列中的尿嘧啶(uracil,U)被識(shí)別為胞嘧啶(cytosine,C),于是會(huì)得到相對(duì)應(yīng)的cDNA序列中的胸腺嘧啶(thymine,T)到C的突變,由此可推測(cè)該位點(diǎn)是RBP的結(jié)合位點(diǎn)。但是PAR-CLIP技術(shù)也有一定局限性:由于需要在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)將4SU或6SG代謝進(jìn)入RNA,此方法僅限于細(xì)胞水平,不適用于組織樣品;細(xì)胞傾向于不使用非天然核苷酸類似物,這限制了4SU或6SG代謝進(jìn)入細(xì)胞的效率;長(zhǎng)時(shí)間的攝入4SU或6SG可能會(huì)引起細(xì)胞毒性[12]。因此,仍然需要新的方法來(lái)提高交聯(lián)效率并且實(shí)現(xiàn)對(duì)RP復(fù)合物的更深覆蓋。

CLIP及其衍生技術(shù)被廣泛應(yīng)用于酵母、真菌、哺乳動(dòng)物的RNA-蛋白質(zhì)相互作用研究中。值得一提的是,Castello等[13,14]利用UV交聯(lián)結(jié)合oligo(dT)富集與質(zhì)譜鑒定poly(A) RBP,發(fā)展了RIC(RNA-interactome capture)策略,可以大規(guī)模富集RBP。結(jié)合生物質(zhì)譜技術(shù),該策略在人宮頸癌細(xì)胞HeLa中鑒定到860個(gè)高置信的RBPs,極大地補(bǔ)充了人們對(duì)RBPs的認(rèn)知。然而,這種方法基于RNA的poly(A)尾巴(主要是mRNA),而mRNA僅占細(xì)胞中RNA總質(zhì)量的3%～5%[3]。并且不是所有mRNA都帶有poly(A)尾巴[15],poly(A)的長(zhǎng)度也不盡相同[16],導(dǎo)致部分mRNA也很難被oligo(dT)捕獲。因此,RIC策略遺漏了大量RP復(fù)合物,無(wú)法鑒定ncRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物乃至全類型RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。

圖 2 CARIC策略工作流程示意圖[17]Fig. 2 Schematic of the workflow of click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC)[17]

1.2 基于“點(diǎn)擊化學(xué)”的富集策略

鑒于RIC策略的局限性,最近一種基于代謝標(biāo)記結(jié)合“點(diǎn)擊化學(xué)”反應(yīng)的RNA捕獲策略能夠不依賴RNA的poly(A)尾巴,更廣泛的富集鑒定RP復(fù)合物。Huang等[17]開發(fā)的CARIC(click chemistry-assisted RNA-interactome capture)策略能富集全類型RP復(fù)合物,見(jiàn)圖2。其主要思路是:首先將5-炔基尿苷(5-ethynyluridine,5-EU,簡(jiǎn)稱EU)與4SU代謝進(jìn)同一條RNA中,EU提供了進(jìn)行點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的炔基,然后在UV 365 nm照射下使RNA與RBP交聯(lián),接著利用疊氮與炔基的生物正交“點(diǎn)擊化學(xué)”反應(yīng)在EU的位置上引入生物素基團(tuán),最后利用生物素與鏈霉親和素之間的強(qiáng)相互作用實(shí)現(xiàn)細(xì)胞中所有RP復(fù)合物的富集與捕獲,其中一部分使用蛋白酶K處理進(jìn)行RNA-seq分析,另一部分使用RNase A處理進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。與之類似的,Bao等[18]開發(fā)的RICK(RNA interactome using click chemistry)策略也利用代謝標(biāo)記結(jié)合“點(diǎn)擊化學(xué)”反應(yīng)將生物素標(biāo)記在RNA上用于富集鑒定,不同之處是他們只將EU代謝進(jìn)RNA,在254 nm UV條件下交聯(lián)。利用這種基于“點(diǎn)擊化學(xué)”的方法可以鑒定到除mRNA之外的各種類型的ncRNA,包括長(zhǎng)非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)和核小RNA(small nuclear,snRNA),是方法學(xué)上的重大突破。然而,由于需要將非天然核苷代謝進(jìn)RNA,這種策略面臨和PAR-CLIP類似的局限性,例如僅限于細(xì)胞水平研究和存在一定的細(xì)胞毒性,并且分析的靈敏性很大程度上取決于EU的代謝標(biāo)記效率。

1.3 基于相分離的富集策略

圖 3 基于相分離的RP復(fù)合物富集方法[20]Fig. 3 Phase separation-based approaches to enrich RP-complexes[20]

早期研究RNA提取時(shí)常采用基于酸性苯酚的相分離法[19]。首先破碎細(xì)胞,將核酸蛋白復(fù)合物中的蛋白質(zhì)變性并釋放出核酸,接著采用苯酚抽提,苯酚的誘導(dǎo)極化作用會(huì)使蛋白質(zhì)內(nèi)外翻轉(zhuǎn),疏水性側(cè)鏈暴露在外部,極性殘基翻轉(zhuǎn)到內(nèi)部,從而將水相中的蛋白質(zhì)萃取出來(lái)。同時(shí),由于DNA和RNA在特定pH值下的溶解度不同,低pH條件下(pH<5)的苯酚使RNA進(jìn)入水相,而DNA維持不溶解的狀態(tài)。最終在酸性苯酚萃取下RNA進(jìn)入上層水相,而大多數(shù)DNA和蛋白質(zhì)則保留在中間層或者下層有機(jī)相中。最近發(fā)展了一系列基于UV交聯(lián)和相分離原理的富集策略,交聯(lián)后的RP復(fù)合物會(huì)集中在水相與有機(jī)相之間的界面,再經(jīng)過(guò)進(jìn)一步純化可以實(shí)現(xiàn)RP復(fù)合物的分離富集,見(jiàn)圖3[20]。正交有機(jī)相分離(orthogonal organic phase separation,OOPS)策略[21]正是基于這種思路,使用酸性異硫氰酸胍-苯酚-氯仿(acidic guanidinium-thiocyanate-phenol-chloroform,AGPC)作為有機(jī)相,通過(guò)連續(xù)多次AGPC萃取后得到RP復(fù)合物,然后通過(guò)RNase消化RNAs獲得分配到有機(jī)相的RBPs,最后通過(guò)質(zhì)譜鑒定在HEK293、U2OS和MCF10A 3種人類細(xì)胞系中共鑒定到了1 838個(gè)RBPs,包括926個(gè)推定的RBPs,其中約80%的RBPs與先前報(bào)道的不依賴poly(A)的策略(CARIC和RICK)結(jié)果一致,這說(shuō)明OOPS具有更全面的分離富集RP復(fù)合體的能力,此外OOPS還可以進(jìn)行RNA-蛋白質(zhì)相互作用的動(dòng)態(tài)分析。另一種基于相分離的策略是苯酚-甲苯萃取(phenol-toluol extraction,PTex)策略[10],不同之處是有機(jī)相為pH 7.0的苯酚-甲苯(50∶50,v/v)混合溶液。在這種體系下,RNAs、蛋白質(zhì)和RP復(fù)合物分配在上層水相中,DNA和脂質(zhì)在中間層,回收水相后與酸性苯酚混合進(jìn)行多次萃取得到RP復(fù)合物。通過(guò)這種分離策略從HEK293細(xì)胞中鑒定出共3 037個(gè)RBPs,回收率約為30%～50%。為了進(jìn)一步提高RP復(fù)合物的富集選擇性,一種新的策略XRNAX(protein-crosslinked RNA extraction)聯(lián)合TRIzol(total RNA isolation)試劑相分離與二氧化硅實(shí)現(xiàn)RP復(fù)合物的富集[22]。TRIzol常用于總RNA分離純化,能保持RNA的完整性,主要成分是苯酚。XRNAX的主要思路是:首先利用TRIzol將DNA、蛋白質(zhì)和RP復(fù)合物分布在中間層,回收中間層后通過(guò)DNase消化DNA。由于硅膠柱在標(biāo)準(zhǔn)條件下可以保留RNA,但不保留與蛋白質(zhì)交聯(lián)的RNA,通過(guò)蛋白酶部分酶解得到RNA-肽段復(fù)合物使其可以保留在硅膠柱中,從而有效富集了RNA-肽段復(fù)合物。除去非交聯(lián)的肽段后,對(duì)RBPs的富集選擇性從69%增加到89%。結(jié)合在3種細(xì)胞系(MCF7、HeLa和HEK293)中的應(yīng)用結(jié)果,共鑒定到1 753個(gè)RBPs,其中有858個(gè)RBPs是3種細(xì)胞系共有的。

相分離策略不依賴于RNA特定序列,完全根據(jù)RP復(fù)合物的理化性質(zhì)實(shí)現(xiàn)分離富集,然而由于利用了UV交聯(lián),相分離策略也面臨著UV偏好性、穿透力弱、交聯(lián)效率低等問(wèn)題,而且糖蛋白具有與RP復(fù)合物類似的理化性質(zhì),可能會(huì)污染富集產(chǎn)物。

2 總結(jié)與展望

RP復(fù)合物富集策略的不斷創(chuàng)新使方法學(xué)取得了重大進(jìn)步,從而大大提高了RBP在不同物種中的覆蓋深度,為基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的研究提供了重要的參考依據(jù)。本文對(duì)不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了比較和討論,以方便研究者們選擇合適的策略來(lái)解決感興趣的生物學(xué)問(wèn)題。由于當(dāng)前的RP復(fù)合物富集方法仍然存在效率低和操作繁瑣等問(wèn)題,因此迫切需要高效、易于實(shí)施并適用于不同類型樣品的新方法。目前亟待解決的問(wèn)題包括:1)基于UV或甲醛的交聯(lián)策略仍存在選擇性和交聯(lián)效率有限等局限,因此需要開發(fā)新的交聯(lián)劑或交聯(lián)策略。2)目前已經(jīng)成功鑒定出數(shù)千個(gè)RBPs,而與RNAs的結(jié)合RBP位點(diǎn)鑒定數(shù)量卻較少(僅報(bào)道了幾百個(gè))。因此,需要更為特異的RNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)策略和高靈敏度質(zhì)譜分析方法。3)目前用于驗(yàn)證新發(fā)現(xiàn)的RBPs的方法通量較低,難以滿足大規(guī)模驗(yàn)證RNA-蛋白質(zhì)相互作用的重大需求。