張金微，孟 玥，侯鐵英△

1.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510515；2.廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院檢驗科，廣東廣州 510080

溶酶體四次跨膜蛋白B(LAPTM4B)基因是劉軍建等[1]首次發(fā)現(xiàn)的一條在大多數(shù)肝癌細胞中高表達，而在正常肝細胞中低表達的新基因。該基因已被證實在多種腫瘤中高表達[2-6]。與此同時，LAPTM4B*2型等位基因已被證實與多種腫瘤的易感性相關(guān)[7]，同時研究發(fā)現(xiàn)在直腸癌、肝癌、胃癌等癌癥中的LAPTM4B*2型等位基因高表達與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與腫瘤組織分化程度呈負相關(guān)[8-10]。但是，LAPTM4B基因多態(tài)性在乳腺癌中的表達及其臨床病理意義尚無明確定論。本研究擬對LAPTM4B基因多態(tài)性與乳腺癌易感性、臨床病理特征的相關(guān)性進行分析，初步探索LAPTM4B基因在乳腺癌中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2010—2019年就診于廣東省人民醫(yī)院的乳腺癌患者424例為病例組，年齡24～73歲，所有病例均經(jīng)病理學(xué)證實為原發(fā)性乳腺癌。選取同期該院體檢健康者238例為對照組，年齡21～78歲，兩組年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.098)，具有可比性。收集所有病例組患者的臨床病例資料，包括年齡、原發(fā)腫瘤大小、腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)、病理學(xué)類型、病理學(xué)分級、雌激素受體(ER)狀態(tài)、孕激素受體(PR)狀態(tài)、激素受體(HR)狀態(tài)、人類表皮生長因子受體2(HER2)狀態(tài)、Ki-67指數(shù)等。根據(jù)腫瘤細胞的ER、PR、HER2狀態(tài)及Ki-67指數(shù)進行分子分型分類：Luminal A型(ER、PR陽性，HER2陰性，Ki-67≤14)，Luminal B 型+HER2陰性[ER和(或)PR陽性，HER2陰性，Ki-67>14]，Luminal B型+HER2 陽性(ER陽性，PR陽性或陰性，HER2陽性)，HER2陽性型(HR、ER、PR陰性，HER2陽性)，三陰型(ER、PR、HER2均陰性)。

1.2儀器與試劑 DNA提取試劑盒購自北京天根公司；Allegra 64R高速臺式離心機購自美國貝克曼庫爾特公司；ABI 9700 PCR擴增儀購自美國賽比奧公司；Sub-cell大型電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1基因組DNA提取 取所有研究對象外周血10 mL，以乙二胺四乙酸二鉀抗凝處理，嚴格按照外周血DNA提取試劑盒說明書提取純化基因組DNA，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2PCR擴增 采用DNA提取試劑盒對提取純化的基因組DNA進行PCR擴增。LAPTM4B引物，上游：5′-GCC GAC TAG GGG ACT GGC GGA-3′，下游：5′-CGA GAG CTC CGA GCT TCT GCC-3′。內(nèi)參β-actin引物，上游：5′-TCA CCA ACT GGG ACG ACA T-3′，下游：5′-AGG TAG TCA GTC AGG TCC CG-3′。反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，擴增33個循環(huán);最后于72 ℃，延長反應(yīng) 5 min。

1.3.3瓊脂糖凝膠電泳 將PCR產(chǎn)物加樣在2.5%瓊脂糖凝膠中，100 V，40 min電泳鑒定。LAPTM4B*1/1型可擴增出1條204 bp片段，LAPTM4B*1/2型可分別擴增出1條204 bp片段和1條223 bp片段，LAPTM4B*2/2型可擴增出1條223 bp片段，β-actin可擴增出1條340 bp片段。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS25.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析。通過χ2檢驗判斷病例組與對照組的等位基因是否符合Hardy-weinberg平衡；采用比值比(OR)和95%置信區(qū)間(CI)評估相關(guān)因素對乳腺癌危險度的影響；χ2檢驗分析LAPTM4B基因多態(tài)性與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1數(shù)據(jù)符合Hardy-weinberg平衡 用病例組與對照組各基因型表達的實際頻率與期待頻率做χ2檢驗，驗證病例組(P=0.104)和對照組(P=0.165)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，所用數(shù)據(jù)可以代表各自人群。

2.2LAPTM4B基因多態(tài)性的分布情況 研究納入的424例乳腺癌患者中，LAPTM4B*1/1型、LAPTM4B*1/2型、LAPTM4B*2/2型分布頻率分別為36.3%(154/424)、44.8%(190/424)、18.9%(80/424)。與LAPTM4B 1型(*1/1型)比較，LAPTM4B 2型(*1/2型+*2/2型)在乳腺癌患者中的分布頻率更高(占63.7%)。見表1。

2.3LAPTM4B基因多態(tài)性與乳腺癌易感性的關(guān)系 病例組中LAPTM4B*2型等位基因的分布頻率較對照組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；基因型分布在兩組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；*1/2型和*2/2型基因攜帶者患乳腺癌的危險性分別是*1/1型的1.488倍(95%CI1.061～2.085，P=0.021)與4.915倍(95%CI2.612～9.249，P<0.05)。*2型等位基因攜帶者患乳腺癌的危險性是*1型等位基因的1.911倍(95%CI1.496～2.440，P<0.05)。見表1。

2.4LAPTM4B基因多態(tài)性與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性 LAPTM4B基因多態(tài)性與乳腺癌患者腫瘤大小、病理學(xué)分級、淋巴結(jié)狀態(tài)及ki-67的表達情況有相關(guān)性(P<0.05)；與腫瘤位置、有無遠處轉(zhuǎn)移、分子分型均無相關(guān)性(P>0.05)，見表2。

表1 兩組基因型及等位基因分布情況[n(%)]

表2 LAPTM4B基因多態(tài)性與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

3 討 論

乳腺癌是嚴重威脅女性生命健康的惡性腫瘤，發(fā)病率位居我國女性惡性腫瘤的首位，病死率位居我國女性惡性腫瘤的第二位[11]。常規(guī)的乳腺癌的治療方法包括手術(shù)、放療和化療這3種方式單獨或者聯(lián)合使用[12]。近年來，乳腺癌的靶向治療越來越受到臨床重視[13]。盡管乳腺癌診療水平不斷取得進步，乳腺癌的病死率已經(jīng)有所降低，但乳腺癌的診斷和治療仍舊是一大難題[14-15]。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展涉及基因突變、積聚的多個階段，導(dǎo)致腫瘤異常的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)。因此，發(fā)現(xiàn)和研究新的乳腺癌相關(guān)基因，尋找新的診斷及治療靶點，是一項十分迫切且有重要現(xiàn)實意義的工作。

LAPTM4B基因位于染色體8q22.1，長度約50 kb，其由7個外顯子及6個內(nèi)顯子組成，包含1個951核苷酸的開放閱讀框[16]。LAPTM4B可編碼2種不同的蛋白：LAPTM4B-35和LAPTM4B-24。LAPTM4B-35蛋白被證實與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，在肺癌和肝癌等腫瘤中高表達，LAPTM4B-35基因的表達水平與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移率呈正相關(guān)，與腫瘤的分化程度呈負相關(guān)[17-18]。

此外，已發(fā)現(xiàn)LAPTM4B基因有2種等位基因LAPTM4B*1型及LAPTM4B*2型，二者唯一的區(qū)別在于LAPTM4B*2型第1外顯子5′端非翻譯區(qū)處存在2個串聯(lián)重復(fù)的19 bp序列，而LAPTM4B*1型該區(qū)僅有1個該19 bp序列[19]。2種等位基因構(gòu)成的基因型有LAPTM4B*1/1，LAPTM4B*1/2，LAPTM4B*2/2 3種。由于有2種等位基因的存在，LAPTM4B基因呈現(xiàn)多態(tài)性。

MENG等[20]研究表明，子宮內(nèi)膜癌人群LAPTM4B*2型基因分布頻率高于健康人群，*1/2型和*2/2型相對于*1/1基因型個體患子宮內(nèi)膜癌的風險更高(OR值分別為1.572和2.335)。此外，WANG等[21]的研究結(jié)果也表明肝癌人群*1/2和*2/2基因型頻率高于健康人群(OR值分別為1.898和2.483)。這提示LAPTM4B基因與子宮內(nèi)膜癌及肝癌的易感性相關(guān)。但是上述研究尚未發(fā)現(xiàn)LAPTM4B基因多態(tài)性與該腫瘤臨床病理特征的明顯相關(guān)性，原因可能與LAPTM4B基因在不同腫瘤之間的作用機制存在差異性，以及上述研究病例數(shù)不足有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，病例組中*2型等位基因的分布頻率為41.3%，高于對照組的26.9%，攜帶*2型等位基因相對于*1型等位基因可使個體患乳腺癌的危險性增加1.911倍(95%CI1.496～2.440，P<0.05)。其中病例組*1/2基因型和*2/2基因型攜帶者患乳腺癌的危險性分別是*1/1基因型的1.488倍(95%CI1.061～2.085，P=0.021)與4.915倍(95%CI2.612～9.249，P<0.05)。這些結(jié)果均提示*2等位基因也與乳腺癌的易感性有關(guān)。LAPTM4B*1型及LAPTM4B*2型2個等位基因唯一區(qū)別在于非編碼區(qū)的19 bp序列不同。因此，不同等位基因?qū)δ[瘤不同的易感性很大可能歸結(jié)于19 bp基因序列的數(shù)目不同。既往研究提示，LAPTM4B*2型等位基因多出的19 bp序列，一方面可能因存在更多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，促使相關(guān)基因更多結(jié)合于LAPTM4B*2啟動子區(qū)，促進LAPTM4B基因上調(diào)，以及乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展；另一方面LAPTM4B*2型等位基因也有可能由于19 bp序列的插入，導(dǎo)致mRNA翻譯起始密碼子前移，產(chǎn)生新的促腫瘤發(fā)生的蛋白[22-23]。

LAPTM4B基因已被報道有促進腫瘤細胞增殖、侵襲，啟動自噬，抑制腫瘤細胞凋亡，協(xié)助耐藥性產(chǎn)生的作用[24]。在小鼠體內(nèi)，敲低LAPTM4B基因可明顯阻斷骨肉瘤細胞的增殖和侵襲，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，為LAPTM4B基因作為骨肉瘤治療的新靶點提供可能[25]。一項Meta分析顯示，LAPTM4B*2型等位基因的攜帶者較LAPTM4B*1 型等位基因攜帶者其罹患腫瘤的風險更高，且LAPTM4B*2 型等位基因被證實為腫瘤的風險因子之一[26]。LAPTM4B 2型(*1/2型+*2/2型)與腫瘤分期顯著相關(guān)[27]。本研究針對424例經(jīng)病理確診為乳腺癌的患者進行了LAPTM4B等位基因分型。研究結(jié)果顯示，LAPTM4B*1/1型、LAPTM4B*1/2型、LAPTM4B*2/2型分布頻率分別為36.3%(154/424)、44.8%(190/424)、18.9%(80/424)。與LAPTM4B 1型(*1/1型)比較，LAPTM4B 2型(*1/2型+*2/2型)在乳腺癌患者的分布頻率更高(占63.7%)。同時，本研究進一步觀察了LAPTM4B基因多態(tài)性與乳腺癌患者各臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果表明LAPTM4B基因多態(tài)性與乳腺癌患者腫瘤大小、病理學(xué)分級、淋巴結(jié)狀態(tài)及ki-67表達情況有相關(guān)性(P<0.05)。與腫瘤位置、有無遠處轉(zhuǎn)移、分子分型均無相關(guān)性(P>0.05)。提示 LAPTM4B基因可能與乳腺癌惡性程度及侵襲能力相關(guān)。本研究結(jié)果表明，LAPTM4B*2/2型乳腺癌患者的腫瘤最大徑>2 cm、病理學(xué)分級Ⅲ級、淋巴結(jié)陽性、ki-67≥30%所占比例明顯高于LAPTM4B*1/1 型、LAPTM4B*1/2 型，提示與其他2種基因型比較，LAPTM4B*2/2型乳腺癌患者腫瘤的惡性程度更高、侵襲能力更強。但由于本研究缺乏患者治療隨訪情況，給預(yù)后評估帶來一定困難，無法進行3種基因型間的預(yù)后比較。此外有研究發(fā)現(xiàn)，相對于乳腺癌其他分子分型，LAPTM4B在三陰型乳腺癌中表達最高[28]。本研究尚未發(fā)現(xiàn)LAPTM4B基因多態(tài)性與乳腺癌分子分型的相關(guān)性。當然，可能與中國乳腺癌以Luminal A型為主，三陰型乳腺癌病例數(shù)較少有關(guān)。筆者認為研究樣本數(shù)量還有待增加，以滿足更多分層因素中數(shù)據(jù)的量化，來進一步闡明臨床資料的相關(guān)性。

綜上所述，本研究證實了LAPTM4B*2型等位基因與乳腺癌易感性相關(guān)，因此，LAPTM4B*2型等位基因可作為篩查乳腺癌易感人群和高危人群的指標，有較大的應(yīng)用價值。此外，攜帶LAPTM4B*2型等位基因乳腺癌患者其腫瘤可能有更高的生長、侵襲、浸潤能力，提示LAPTM4B 可能會成為乳腺癌篩查及治療的潛在靶點，可間接為乳腺癌患者臨床治療方案的選擇及預(yù)后評估提供參考依據(jù)。