吳婷娜，王旻晉，鐘方財(cái)，郭 碩，周妍冰，孟子芮，應(yīng)斌武△

1．四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，四川成都 610041；2．四川省內(nèi)江市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川內(nèi)江 641000

病原體侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)可引起感染性病變[1]，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致患者死亡。因此，早期、準(zhǔn)確地診斷CNS感染是臨床治療的關(guān)鍵。目前，CNS感染的病原體檢測(cè)主要依靠腦脊液培養(yǎng)、涂片染色和特異性抗原抗體等方法，但檢測(cè)的靈敏度和時(shí)效性較低。

分子生物學(xué)診斷技術(shù)可以對(duì)病原體進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，有利于CNS感染病原體的鑒別與診斷。腦膜炎/腦炎多重PCR(MEMP-19)檢測(cè)技術(shù)是將多重PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳結(jié)合在一起的檢測(cè)技術(shù)，能夠針對(duì)19種臨床常見的CNS感染病原體進(jìn)行檢測(cè)。與傳統(tǒng)方法比較，有靈敏度、特異度、通量均高的優(yōu)點(diǎn)[2-4]。本研究利用MEMP-19技術(shù)對(duì)疑似CNS感染患者的腦脊液病原體進(jìn)行檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)篩選后將擬研究病例分為疑似CNS感染組(A組)與非CNS感染的其他神經(jīng)系統(tǒng)病變組(B組)，見圖1。A組68例，為疑似CNS感染入院治療的患者，臨床表現(xiàn)有疑似CNS感染的癥狀或體征，如發(fā)熱、頭痛、意識(shí)改變等，伴或不伴腦脊液異常，腦脊液白細(xì)胞數(shù)≥5×106/L，蛋白濃度>0.45 g/L；B組140例，包括顱內(nèi)占位性病變、自體免疫性腦炎、神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變等臨床診斷為非CNS感染性疾病的患者。所有患者入院時(shí)間為2019年10-11月。腦脊液標(biāo)本收集納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)腦脊液標(biāo)本量≥1 mL，紅細(xì)胞水平<10×1012/L；(2)腦脊液應(yīng)在抗菌治療或免疫制劑治療前采集；(3)收集患者臨床信息。

1.2儀器與試劑 Easy-MAG核酸提取儀及其配套試劑購自上海梅里埃診斷產(chǎn)品有限公司；MEMP-19及其配套試劑購自寧波海爾施基因科技有限公司；ABI3500 Genetic Analyzer、 Applied Biosystems PCR擴(kuò)增儀均購自美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3方法 使用MEMP-19技術(shù)對(duì)納入病例的腦脊液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，包括19種CNS感染常見病原體：腦膜炎奈瑟菌、結(jié)核分枝桿菌(MTB)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(LM)、肺炎鏈球菌、肺炎支原體(MP)、無乳鏈球菌、流感嗜血桿菌(HI)、大腸桿菌K1、腸道病毒(EVs)、人雙?？刹《?、乙型腦炎病毒、水痘帶狀皰疹病毒、腮腺炎病毒、巨細(xì)胞病毒(HCMV)、單純皰疹病毒(HSV)1型、HSV-2、EB病毒(EBV)、人類皰疹病毒6型及新型隱球菌(CN)。分析每種病原體的檢出率，并分析患者的單一感染率和混合感染率。

圖1 病例納入流程圖

2 結(jié) 果

2.1MEMP-19總檢出率 208例患者腦脊液標(biāo)本中有43例檢出至少1種病原體，總檢出率為20.67%。EBV檢出率最高(11.54%)，其次是CN(5.77%)、MTB(3.37%)、EVs(3.37%)及HCMV(1.44%)，HI、HSV-2、LM及MP的檢出率均為0.48%。見表1。

表1 208例患者腦脊液標(biāo)本病原體檢出情況(%)

2.2A組、B組檢出率情況 A組中有33例至少檢出1種病原體，檢出率為48.53%。主要是EBV(29.41%)、CN(17.65%)和MTB(10.29%)；B組共檢出6例EVs和4例EBV，檢出率為7.14%。見表2。

2.3單一感染與混合感染結(jié)果 A組的33例陽性標(biāo)本中，單一感染21例(63.64%)，雙重感染10例(30.30%)，三重感染2例(6.06%)。雙重感染中，EBV與CN共感染5例、EBV與MTB共感染2例、EBV與HCMV共感染1例、MTB與HCMV共感染1例、EVs與CN共感染1例；三重感染中，EBV、MTB及HCMV共感染1例，EBV、CN及MP共感染1例；B組10例均為單一感染。見表3。

表2 兩組腦脊液病原體檢出情況(%)

表3 A組單一感染與混合感染的腦脊液病原體分布(n)

2.4A組MEMP-19檢測(cè)陽性和陰性患者的臨床表現(xiàn)及腦脊液指標(biāo)比較 A組MEMP-19檢測(cè)陽性和陰性患者在發(fā)熱、頭痛、惡心嘔吐、意識(shí)改變、抽搐和腦膜刺激征方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在腦脊液有核細(xì)胞計(jì)數(shù)及腦脊液總蛋白水平比較，差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 A組MEMP-19檢測(cè)陽性和陰性患者的臨床表現(xiàn)及腦脊液指標(biāo)情況

續(xù)表4 A組MEMP-19檢測(cè)陽性和陰性患者的臨床表現(xiàn)及腦脊液指標(biāo)情況

3 討 論

CNS感染是一種常見的感染性疾病，起病急、病情重且進(jìn)展迅速[5]。常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查或臨床癥狀分析，難以準(zhǔn)確診斷CNS感染的病原體。當(dāng)前，分子生物學(xué)診斷技術(shù)正快速發(fā)展并應(yīng)用于CNS感染病原體的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中，但仍存在諸多不足。實(shí)時(shí)熒光定量PCR可在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)一種或幾種已知病原體進(jìn)行快速定性檢測(cè)，但無法用于病原體的高通量篩查；而基于新一代高通量測(cè)序技術(shù)的病原體檢測(cè)，可大幅提高對(duì)病原體的篩查、檢測(cè)能力[6]，但其需要專業(yè)的檢測(cè)平臺(tái)和人員[7]，且價(jià)格較為昂貴。本研究首次利用MEMP-19試劑盒對(duì)四川大學(xué)華西醫(yī)院208例患者的腦脊液標(biāo)本進(jìn)行了病原體檢測(cè)，在疑似CNS感染組中有48.53%的患者檢出病原體，并發(fā)現(xiàn)共感染情況。

本研究中A組檢出的病原體以EBV(29.41%)和HCMV(4.41%)較為常見，且存在單一感染和共感染并存的情況，這與既往CNS共感染相關(guān)研究一致[8-10]。此外，有研究顯示，EBV和HCMV是常見的機(jī)會(huì)性感染病原體[11-12]，可累及多器官系統(tǒng)出現(xiàn)臨床癥狀和持續(xù)感染，免疫力低下患者，尤其是合并人類免疫缺陷病毒感染的患者，應(yīng)考慮EBV和HCMV潛伏感染的可能[13-14]。故僅腦脊液EBV和HCMV檢測(cè)陽性并不能診斷CNS感染，必須結(jié)合臨床癥狀綜合考慮。

此外，A組CN檢出率為17.65%，12例檢出CN的患者中，5例單一感染，7例共感染。CN為條件致病性真菌，是免疫功能低下患者CNS感染常見的病原體[15]，在免疫功能低下患者出現(xiàn)CNS感染癥狀時(shí)，應(yīng)考慮隱球菌性腦膜炎的可能。

結(jié)核性腦膜炎是最嚴(yán)重的肺外MTB感染所致的疾病之一[16]。本研究中A組共檢出7例MTB，檢出率為10.29%，它們的常規(guī)腦脊液培養(yǎng)和抗酸染色檢測(cè)結(jié)果為陰性。由于結(jié)核性腦膜炎的非特異性臨床表現(xiàn)增加了臨床診療難度，因此病原學(xué)檢測(cè)對(duì)結(jié)核性腦膜炎的臨床診斷非常重要，而傳統(tǒng)的MTB檢測(cè)主要是抗酸染色鏡檢及培養(yǎng)，檢出率低且培養(yǎng)耗時(shí)。因此，MEMP-19檢測(cè)非常適用于MTB的臨床快速篩查和檢測(cè)。

除此之外，A組還檢出HI、LM、MP等病原體，但常規(guī)腦脊液培養(yǎng)均為陰性。結(jié)合臨床癥狀及隨訪治療效果進(jìn)行分析，確認(rèn)MEMP-19的檢測(cè)結(jié)果可信。這充分證明了MEMP-19相比傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，能夠更加準(zhǔn)確地對(duì)疑似CNS感染病例的腦脊液病原體進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)合臨床信息進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，A組MEMP-19陽性和陰性的患者在臨床癥狀和體征，以及腦脊液生化指標(biāo)方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這與伊潔等[17]報(bào)道的結(jié)果一致，提示MEMP-19檢測(cè)結(jié)果與患者的臨床表現(xiàn)沒有相關(guān)性，而可能與感染病原體毒力和機(jī)體免疫力有關(guān)。

值得注意的是，本研究中B組檢出EVs及EBV。研究顯示，EVs等嗜神經(jīng)性病毒可建立CNS持續(xù)性感染，如脊髓灰質(zhì)炎病毒RNA在感染數(shù)年后仍能在腦脊液中檢測(cè)到[18]。最近一項(xiàng)研究證明在CNS感染中持續(xù)檢測(cè)到EVs序列與肌萎縮側(cè)索硬化的惡性發(fā)展相關(guān)[19]。也有報(bào)道顯示，EBV在其原發(fā)感染后即建立終身潛伏感染并潛伏于B淋巴細(xì)胞，由此可在無CNS感染臨床癥狀時(shí)檢測(cè)到[20]。因此，臨床需重視病原體在CNS中的潛伏感染和引起相關(guān)并發(fā)癥的情況。

本研究顯示，MEMP-19對(duì)腦脊液病原體有較好的檢出效果，其耗時(shí)短、特異性強(qiáng)且能同時(shí)檢測(cè)多種病原體，因而可為臨床提供早期、快速、可靠并且更加全面的病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果，可提高CNS感染的臨床診斷效能。與傳統(tǒng)的病原體檢測(cè)手段比較，MEMP-19檢測(cè)CNS感染為實(shí)驗(yàn)室診斷提供了新思路。