秦艷芳， 朱留洋， 王聰慧， 孔祥東

(1.濮陽市油田總醫(yī)院，河南 濮陽 457001；2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052)

遺傳性對稱性色素異常癥(dyschromatosis symetrica hereditaria,DSH)，也稱肢端色素沉著癥，在各個種族中可見，但多見于亞洲人，其中中國和日本報道較多[1]。該病主要臨床表現(xiàn)為肢端伸側(cè)出現(xiàn)對稱性色素減退斑和色素沉著斑，尤其是手、足背部明顯，有時面部出現(xiàn)雀斑樣皮損，可不伴色素減退斑，常在嬰兒期或兒童早期出現(xiàn)，青春期表現(xiàn)較為明顯，發(fā)病進程比較緩慢，病程伴隨終生[2-3]。本病一般無自覺癥狀，日曬可加重其癥狀。致病基因為ADAR基因。其組織病理學無典型改變，活檢發(fā)現(xiàn)色素減退斑處黑素缺失時，電鏡下可觀察到黑素細胞狀態(tài)異常；活檢見色素沉著斑處基底層黑素增多時，電鏡下可見黑素細胞代謝活性增高、細胞增多，黑素細胞擁有更多的樹突和大量的Ⅳ期黑素小體[4]。

通過對不同家系及散在發(fā)病者的研究，迄今已發(fā)現(xiàn)二百多種不同的突變，包括錯義突變、無義突變、移碼突變、剪接區(qū)突變和復雜的插入/缺失突變等[5]。導致發(fā)病的主要是錯義突變，發(fā)生在第9～15外顯子的突變達60%以上[6]。本研究對一中國漢族DSH家系行ADAR基因突變檢測，分析其致病性及作出產(chǎn)前診斷。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

先證者，男，6歲，頸部、雙側(cè)關節(jié)、雙手背和足背處色素異常5年余。患者7個月時頸部、雙側(cè)關節(jié)、雙手背和足背處出現(xiàn)散在色素減退斑和沉著斑，針尖及粟粒大小, 隨著年齡增長皮疹面積逐漸增大，并蔓延至雙前臂伸側(cè)、臀部、面部，尤其手部為重。表現(xiàn)為手足背、頸、臀部不規(guī)則色素沉著或減退斑，顏色深淺不一、部分融合成網(wǎng)狀(圖1)，日曬后皮損可加重。黏膜、指(趾)甲、牙齒和毛發(fā)均正常。先證者祖母，自幼發(fā)病，未在意，生育后于外院行皮損活檢診斷為DSH，現(xiàn)已去世，資料丟失。先證者父親，1歲時發(fā)病，未予診治。先證者母親，30歲，再次妊娠，孕18周，擬通過產(chǎn)前診斷檢測胎兒是否患DSH，就診于鄭州大學第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心。本研究經(jīng)鄭州大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(批件號：KS-2018-KY-36)，患者及家屬同意并簽署知情同意書。

圖1 先證者頸部右側(cè)臨床圖片

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采集其家系10個成員(先證者及其父親、母親、姑姑、姑父、表姐、叔叔、嬸嬸、堂姐、堂哥)靜脈血各2 mL，采集先證者母親羊水20 mL，采用美國Promega公司DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2.2 高通量測序及Sanger測序驗證 利用Ion Personal Genome Machi-ne(PGMTM)測序儀進行高通量測序。目標捕獲區(qū)平均測序深度為126 X，測序覆蓋度為98.21%，測序深度大于100 X的靶向讀長達100%，根據(jù)ACMG的遺傳變異分析指南對所有檢測到的變異進行篩選，設計引物并對突變位點進行Sanger測序，分析結(jié)果。

1.2.3 引物設計 根據(jù)ADAR基因第二外顯子編碼區(qū)和側(cè)翼序列設計引物，均由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物：5′-CGGAAGACAGAAACTCCAC-3′，下游引物：5′-CTGCTC ACAAATCAGCCAAG-3′。

1.2.4 PCR擴增 擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共33個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、純化后直接在3130XL一代測序儀(Life公司)上測序，所有測序結(jié)果與dbsnp.1000Genomes Project等數(shù)據(jù)庫相關數(shù)據(jù)進行分析比對。

2 結(jié)果

2.1 家系調(diào)查

經(jīng)調(diào)查，該家系3代有3例發(fā)病(圖2)，男女比例為2 ∶1，結(jié)合該家系遺傳史、典型臨床表現(xiàn)及單基因病種檢測，確診為常染色體顯性遺傳DSH。

圖2 家系譜

2.2 基因變異定性分析及家系胎兒產(chǎn)前診斷

結(jié)果顯示，先證者、先證者父親、先證者母親羊水中均攜帶ADAR 基因c.613C>T(p.Q205X)位點雜合變異，而家系中其他人員未見該改變(圖3)。該突變在dbSNP數(shù)據(jù)庫、1000Genomes Project 數(shù)據(jù)庫中均未找到。使用polyphen2(http://genetics.bwh. Harvard. edu/pph2/)，SIFT(http:// sift. jcvi.org/)和Mutation taster( http: // www. Mutatio -ntaster.org/)等生物信息軟件對該突變進行致病性預測，結(jié)果表明，ADAR 基因c.613C>T(p.Q205X)位點雜合變異是該家系的致病突變而不是單核苷酸多態(tài)性。

圖3 基因測序結(jié)果Fig.3 Gene sequencing results.

3 討論

隨著DSRAD/ADAR基因確定為DSH的致病基因，對于不同家系致病基因突變位點的檢測已成為研究DSH的一個熱點。ADAR基因總長30 kb，有15個外顯子，可編碼1 226個氨基酸[7]。ADAR也稱雙鏈RNA特異性腺苷脫氨酶，該酶選擇性作用于mRNA前體，將相應位點上腺嘌呤核苷(A)脫氨基轉(zhuǎn)換成次黃嘌呤核苷(I)[8]。含有2個腺苷脫氨基酶Zalpha區(qū)域、3個ds-RNA結(jié)合區(qū)域和1個脫氨基區(qū)域，分別對應于外顯子2、外顯子2-7和外顯子9-15[9-10]。該基因不但將mRNA前體特異位點的A編輯為I，還可編輯雙鏈RNA中約40%～50%的An41[11]。彭琛等[7]對一DSH 并發(fā)銀屑病家族進行基因檢測，發(fā)現(xiàn)先證者及家系中其他患者ADAR1 基因均存在第8外顯子突變，家系中非患病者及無家系關系的對照組均未發(fā)現(xiàn)該突變。突變 c.2745_2746del CT(p.D582X)，即在第 8 外顯子中第 2 745～2 746 位堿基C及堿基T缺失，由于框移突變造成第582位密碼子由TCT變成TGA，終止密碼子提前出現(xiàn)，導致其后12個氨基酸缺失，酶的催化功能受損，引起DSH的發(fā)生。

DSH是一種常染色體顯性遺傳病，但也存在散發(fā)病例[12]。曾榮等[5]提取一家系中2例DSH患者外周血DNA，以基因組DNA為模板擴增出PCR產(chǎn)物，并純化后測序，將患者ADAR1基因全部編碼區(qū)測序結(jié)果比對數(shù)據(jù)庫的序列，結(jié)果顯示，2例患者ADAR1基因錯義突變(c.662C>T)，引起ADAR1基因中編碼的色氨酸(CGG)變成精氨酸(TGG)，而家系中未患病及50位與本家系無關的正常人未見該改變。本研究中，該家系3代12人中3例發(fā)病，孕18周的胎兒經(jīng)檢測為確診患者，每代均有發(fā)病，遺傳方式符合常染色體顯性遺傳，無論胎兒為哪種性別，其再發(fā)風險高達50%。

本研究將PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與polyphen2、SIFT和 Mutation taster中相對應的正常人ADAR基因序列進行比對，檢測到該家系中患者出現(xiàn)雜合突變，ADAR基因的第2號外顯子613位堿基胞嘧啶(C)突變成胸腺嘧啶(T)，造成編碼氨基酸的基因發(fā)生無義突變,最終導致第205位氨基酸形成終止密碼子, 即p.Q205X，使ADAR基因所編碼的蛋白提前終止。在表達過程中截短蛋白的產(chǎn)生導致其后大片氨基酸缺失，或可能引起無義介導的mRNA衰減，減少ADAR蛋白的表達，造成單倍劑量不足,促使酶蛋白的催化功能異常，最終導致黑素母細胞功能異常，從而產(chǎn)生DSH相應的臨床癥狀。先證者及先證者父親根據(jù)臨床表現(xiàn)診斷DSH，而臨床表型正常的先證者母親未發(fā)現(xiàn)突變，表明發(fā)現(xiàn)的無義突變(c.613C>T)是該患者的致病突變而不是單核苷酸多態(tài)性。胎兒ADAR基因檢測顯示與先證者及先證者父親基因檢測結(jié)果相同,皆出現(xiàn)c.613C>T(p.Q205X)位點無義突變，從而亦確診為DSH。

經(jīng)查閱國內(nèi)外文獻發(fā)現(xiàn)，本研究報告的c.613C>T(p.Q205X)為未曾報道過的無義突變，該突變擴大了DSH的基因譜。通過基因測序獲得的大量突變數(shù)據(jù)，可為DSH的基因型與表型關聯(lián)、致病機制及治療等進一步研究提供幫助。DSH因病變部位暴露的皮膚影響美觀，常給患者帶來心理負擔。因此，防治關鍵是檢測其致病基因，找出致病基因的突變位點進行產(chǎn)前篩查，同時作出產(chǎn)前診斷，預防下一代患者的發(fā)生。

產(chǎn)前診斷技術是指利用超聲檢查、母體血清學篩查、無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測、胎兒染色體核型分析、熒光原位雜交、染色體芯片分析及二代測序等技術對胚胎或胎兒的發(fā)育情況及是否患病等方面進行檢測診斷[13]。利用產(chǎn)前診斷技術可盡早發(fā)現(xiàn)缺陷胎兒，并判斷其能否繼續(xù)妊娠，從而降低出生缺陷率，減輕家庭和社會的經(jīng)濟和精力負擔、提高生活質(zhì)量等。本研究中，先證者父母再次懷孕時，為避免生育遺傳性對稱性色素異?；颊叨M行產(chǎn)前診斷。先證者長大成人婚育前建議進行遺傳咨詢。

致謝：感謝鄭州大學第一附屬醫(yī)院老師在實驗過程中的幫助及指導。