侯小濤，李 聰，郝二偉，杜正彩，許翠霞，鄧家剛

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530200；3.廣西農(nóng)作物廢棄物功能成分研究協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530200）

甘蔗葉是禾本科植物甘蔗SaccharumOfficinarum的干燥葉，八角茴香葉為木蘭科植物八角Illicium verumHook.f.的新鮮葉子，柚葉為蕓香科植物柚Citrus grandis（L.）Osbeck 的新鮮葉子，三種均為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的農(nóng)作物廢棄物。目前，國內(nèi)外對甘蔗葉、柚葉、八角茴香葉等農(nóng)作物廢棄物的處理方法多為焚燒和丟棄，造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。前期研究顯示，此3 種農(nóng)作物廢棄物均具有一定的藥用價值。中藥洗液是常見的外用制劑，臨床中常用于婦科炎癥［1-2］、皮炎［3］、濕疹［4］、痔瘡術(shù)后［5］等，具有起效快、安全、制備工藝簡單等特點(diǎn)。為充分利用農(nóng)作物廢棄物，變廢為寶，提高甘蔗、柚、八角茴香3 種農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)價值，廣西農(nóng)作物廢棄物功能成分協(xié)同創(chuàng)新中心主任鄧家剛教授結(jié)合臨床用藥經(jīng)驗(yàn)，以甘蔗葉、桑白皮、柚葉、八角茴香葉、兩面針、救必應(yīng)、薄荷油組成復(fù)方甘桑洗液，臨床用于婦科炎癥具有較好療效。本研究探討復(fù)方甘桑洗液的抗菌、止癢作用，為開發(fā)新制劑及其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1菌種 大腸埃希菌（ATCC29522）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、白色念珠菌（ATCC10231）等3 株菌種購自廣東省微生物菌種保藏中心；銅綠假單胞菌（ATCC27853）由廣西中醫(yī)藥大學(xué)微生物與免疫教研室保藏中心提供。

1.2動物 SPF級ICR種小鼠60只，雌性，體質(zhì)量20±2 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2016-002。小鼠自由攝食和飲水，溫度20～25 ℃，相對濕度55%～70%，自然光照，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.3主要藥物與試劑 復(fù)方甘桑洗液（廣西大海陽光藥業(yè)有限公司，批號：S161201）；潔爾陰洗液（四川恩威制藥有限公司，批號：170417）；營養(yǎng)瓊脂（批號：1064851）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（批號：3105780）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號：3106001）、麥?zhǔn)媳葷峁埽ㄅ枺?105248）均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)；4-氨基吡啶（上海麥克林生化科技公司，純度98%，批號：C10096638）；硫化鈉（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號：20170327）。

1.4儀器 牛津杯（規(guī)格：7.8 mm×6.0 mm×10.0 mm）；超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號：SW-CJ-2FD）；生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號：LRH-150F）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，型號：YXQ-LS-50S11）；電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺（日本Mitutoyo公司，型號：500-196）。

2 方法與結(jié)果

2.1復(fù)方甘桑洗液的制備 將甘蔗葉750 g、桑白皮300 g、救必應(yīng)450 g、毛兩面針750 g 等4 味藥除去雜質(zhì)，用純凈水沖冼干凈，稍潤，切段，收集在托盤中，置烘房內(nèi)于60 ℃下干燥至含水量為8%～12%。取出，裝入潔凈的容器中備用。新鮮柚葉及八角茴香葉除去雜質(zhì)后用純凈水沖冼干凈，稍潤，取出，裝入潔凈的容器中備用。按多功能提取罐操作規(guī)程進(jìn)行操作，將凈制后的八角茴香葉450 g、柚葉450 g置提取罐內(nèi)，加入6倍藥材量的水，提取揮發(fā)油，另存；藥渣加入甘蔗葉、桑白皮、救必應(yīng)、毛兩面針中，每次加入8 倍藥材量的水，回流提取2次，每次1 h（煮沸開始計時），合并提取液，過濾，濃縮成稠膏狀（相對密度不低于1.10），取出置干燥潔凈的容器內(nèi)備用。將濃縮后的稠膏置離心機(jī)中離心，除去不溶性及其他大分子的雜質(zhì)，取出置潔凈容器內(nèi)備用。將離心后的稠膏加入配制罐中，加入揮發(fā)油，再加入純化水至5 L，過濾，加薄荷油10 g攪拌混合均勻，灌裝，輻射滅菌，制成含生藥量為0.62 g/ml 洗液。此制備過程由廣西大海陽光藥業(yè)有限公司制劑車間完成。

2.2體外抑菌實(shí)驗(yàn)

2.2.1菌種復(fù)蘇及傳代 按說明書分別配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，熱溶解后倒入90 mm 玻璃平板，鋪板厚度為4～5 mm，放涼凝固后備用。取出菌種后將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等3種細(xì)菌劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，白色念珠菌則接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，之后將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌各含細(xì)菌平板置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，白色念珠菌置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。菌種復(fù)蘇后傳代2次以上備用。

2.2.2牛津杯法體外抑菌實(shí)驗(yàn)［6-7］取活化后的菌種，用接種環(huán)挑取少量菌落，放置裝有適量無菌生理鹽水中，充分震搖后用0.5 麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行比濁，再將菌懸液濃度調(diào)整至1×106～6×106CFU/ml，用無菌一次性拭子蘸取菌懸液均勻涂抹于營養(yǎng)瓊脂平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，將3 個牛津杯等距離放置于含菌平板上，按每個0.2 ml的量依次加入復(fù)方甘桑洗液、無菌生理鹽水、潔爾陰洗液，設(shè)3個平行實(shí)驗(yàn)。將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌含細(xì)菌平板置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，白色念珠菌含細(xì)菌平板置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。抑菌圈直徑＜6 mm 為耐藥；抑菌圈直徑6～9 mm為輕度敏感；抑菌圈直徑10～14 mm 為中度敏感；抑菌圈直徑15～20 mm 為高度敏感；抑菌圈直徑＞20 mm 為極度敏感。結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，復(fù)方甘桑洗液對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌均為輕度敏感，對金黃色葡萄球菌為極度敏感，其抑制效果略優(yōu)于陽性藥潔爾陰洗液。

表1 牛津杯法測定藥物抑菌圈直徑的結(jié)果 （mm，±s）

表1 牛津杯法測定藥物抑菌圈直徑的結(jié)果 （mm，±s）

藥物復(fù)方甘桑洗液潔爾陰洗液生理鹽水大腸埃希菌6.59±0.42 22.35±0.49 0金黃色葡萄菌23.05±1.47 21.04±0.51 0銅綠假單胞菌6.89±0.36 32.84±0.87 0白色念珠菌6.47±0.69 17.45±1.35 0

2.2.3最小抑菌濃度測定（minimal inhibitory concentration，MIC）［8］取滅菌后營養(yǎng)瓊脂及沙氏葡萄糖瓊脂，趁熱按二倍稀釋法［9］配制成復(fù)方甘桑洗液藥物濃度為620 mg/ml、310 mg/ml、155 mg/ml、77.5 mg/ml、38.75 mg/ml、19.38 mg/ml、9.69 mg/ml、4.84 mg/ml、2.42 mg/ml、1.21 mg/ml 共10 個梯度的含藥培養(yǎng)基，每梯度分3 份并按梯度順序標(biāo)記1～10 后傾入培養(yǎng)皿中冷卻凝固后備用。另取1∶1配制的含潔爾陰洗液藥液瓊脂平板3 個作陽性對照組，無藥物瓊脂培養(yǎng)基3 個作陰性對照組。同樣制備方法制備2 份，分別用于檢測藥物對細(xì)菌及白色念珠菌的MIC。取活化后的菌種，配制濃度為1.0×108CFU/ ml 菌懸液。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌3 種細(xì)菌等距離“之”字劃線接種于含藥營養(yǎng)瓊脂平板中，白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖瓊脂平板中，將接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌菌種后的平板置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，接種白色念珠菌菌種后的平板置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后取出，2名研究者同時在光線充足的地方觀察，以完全無菌落生長的平板為復(fù)方甘桑洗液對該菌的最小抑制濃度（MIC），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。結(jié)果顯示，復(fù)方甘桑洗液對白色念珠菌和大腸埃希菌的MIC為620 mg/ml，對銅綠假單胞菌的MIC值為155 mg/ml，對金黃色葡萄球菌MIC值為38.75 mg/ml。結(jié)果見表2。

表2 瓊脂稀釋法體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3對4-氨基吡啶（4-Aminopyridine，4-AP）致癢小鼠的影響［10-11］取ICR 雌性小鼠50 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)后，用10%硫化鈉（新鮮制備的純水配制）對每只小鼠頸背部脫毛，脫毛區(qū)域面積約為2 cm×2 cm。24 h 后選取脫毛區(qū)域無創(chuàng)口的小鼠40 只，隨機(jī)分為4 組：復(fù)方甘桑洗液高劑量組、復(fù)方甘桑洗液低劑量組、潔爾陰對照組及模型組。將小鼠稱重后，按照小鼠面積0.2 ml/cm2劑量用棉簽涂抹給藥，復(fù)方甘桑洗液高劑量組予100%濃度的復(fù)方甘桑洗劑，復(fù)方甘桑洗液低劑量組予50%濃度的復(fù)方甘桑洗液，潔爾陰對照組予100%濃度的潔爾陰洗液，模型組予純水，每間隔2 h給藥1次，每天5次，給藥2 d，末次藥后1 h按10 mg/kg（用生理鹽水配制成0.1 mg/ml）劑量給每只小鼠背部給藥區(qū)域中心皮下注射4-AP，注射后觀察10 min 內(nèi)小鼠舔背部的次數(shù)，以連續(xù)舔體后出現(xiàn)短暫的間隔為1 次，各組舔體次數(shù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，背部涂抹復(fù)方甘桑洗液藥液后的小鼠舔體次數(shù)顯著減少，給藥濃度對小鼠舔體次數(shù)影響較小，高劑量組小鼠舔體次數(shù)略低于低劑量組，復(fù)方甘桑洗液高、低劑量組的止癢作用均顯著優(yōu)于潔爾陰對照組（P＜0.01）。

表3 各組10 min內(nèi)小鼠舔體次數(shù)比較 （±s）

表3 各組10 min內(nèi)小鼠舔體次數(shù)比較 （±s）

注：與模型組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與潔爾陰對照組比較，③P＜0.01

組 別模型組復(fù)方甘桑洗液高劑量組復(fù)方甘桑洗液低劑量組潔爾陰對照組n 10 10 10 10濃度（%）—100 50 100舔體次數(shù)（次）22.60±6.48 6.30±2.94②③8.00±3.20②③15.50±5.28①

3 討 論

復(fù)方甘桑洗液由甘蔗葉、桑白皮、柚葉、八角茴香葉、兩面針、救必應(yīng)、薄荷油組成，其中甘蔗葉具有抗菌［12］、抗炎［13］、降血糖［14］、肝損傷保護(hù)［15］等作用，桑白皮具有抗炎鎮(zhèn)痛、降血糖、抗病毒等作用［16］，在方中與甘蔗葉共為君藥，提升甘蔗葉的抗炎效果。救必應(yīng)為冬青科植物鐵冬青的樹皮，具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用［17］；兩面針為蕓香科植物兩面針的根和葉，具有抗菌、抗炎等作用［18］；兩味中藥均具有抗多種細(xì)菌及白色念珠菌的作用，在方中為臣藥。八角茴香葉具有揮發(fā)油成分，其水提物具有一定的抗菌作用［19-20］；柚葉中的柚皮苷具有較好的抑制多種細(xì)菌生長的作用［21-23］，廣西壯族民間常用于婦女產(chǎn)后康復(fù)；此兩味藥物具有一定的抗菌作用，且其揮發(fā)油氣味芳香，與薄荷油共同起佐助作用，提升抑菌抗炎能力；并通過促進(jìn)透皮吸收，使洗液具有較好的抑菌止癢能力。

陰道炎是常見的婦科疾病之一，其病因主要由于多種細(xì)菌（如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等）、白色念珠菌及滴蟲等病原體在陰道中過度增殖，使陰道內(nèi)環(huán)境失衡而引起炎癥，往往會伴隨著外陰瘙癢。西醫(yī)多用抗生素抑制病原體的增殖，中醫(yī)多采用內(nèi)服外治辨證治療［24-25］。目前，測定藥物對細(xì)菌的敏感性多采用抑菌圈法，其中包含了牛津杯法、K-B 法、打孔法，牛津杯法因其獲得的抑菌圈質(zhì)量高，重復(fù)性好及方法規(guī)范等優(yōu)點(diǎn)而優(yōu)于K-B 法及打孔法［26］。測定藥物對菌種的MIC 時多采用瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法、微量稀釋法3種，而復(fù)方甘桑洗液為棕褐色液體，使用瓊脂稀釋法可排除干擾，獲得比較準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故而本研究使用牛津杯法檢測復(fù)方甘桑洗液對4 株標(biāo)準(zhǔn)菌株的藥物敏感性，以及使用瓊脂稀釋法測定MIC。結(jié)果顯示，復(fù)方甘桑洗液對4 種標(biāo)準(zhǔn)菌株均有一定的抑制作用，對大腸埃希菌及白色念珠菌效果較差，對金黃色葡萄球菌效果最好，與市售陽性藥（潔爾陰洗液）比較具有一定的優(yōu)勢。

瘙癢是一種能引起抓撓沖動的主觀感覺，是神經(jīng)反射導(dǎo)致的結(jié)果，由多種因素（蚊蟲叮咬、炎癥刺激等）導(dǎo)致。4-AP 是一種具有促進(jìn)肥大細(xì)胞釋放瘙癢介質(zhì)組胺的化合物，被廣泛應(yīng)用于建立瘙癢動物模型中［27］。本研究采用皮下注射4-AP 于小鼠頸后部的方法建立瘙癢模型，給藥后通過觀察各組小鼠舔體次數(shù)測定復(fù)方甘桑洗液的止癢作用，結(jié)果顯示復(fù)方甘桑洗液具有顯著的止癢作用，且效果優(yōu)于市售陽性藥。

綜上，本研究充分利用了農(nóng)作物廢棄物的藥用功能，以傳統(tǒng)抗菌中藥組方，起到了顯著的抗菌、止癢的作用，為將農(nóng)作物廢棄物開發(fā)成藥用產(chǎn)品并應(yīng)用于臨床提供了科學(xué)依據(jù)，能為促進(jìn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展提供支持。