（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南省畜禽繁育與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002）

牛支原體（Mycoplasma bovis）是一種主要的、但通常被忽視的病原體，它屬于柔膜體綱，是以缺乏細(xì)胞壁、最小的、能自我復(fù)制為特征的微生物。主要引起牛的肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、角膜結(jié)膜炎、生殖道炎癥以及流產(chǎn)和不孕等疾病，對(duì)全世界的養(yǎng)牛業(yè)構(gòu)成了主要威脅[1,2]。在中國，自2008年以來，該病原體已被證明對(duì)牛的健康構(gòu)成威脅，大約10%的致死率主要是由牛支原體引起的肺炎，到目前為止，還沒有有效的疫苗來阻止牛支原體的感染。與此同時(shí)，由于細(xì)菌耐藥性的增強(qiáng)，抗生素治療正在降低其有效性，使得它的控制變得難以實(shí)現(xiàn)和困難[3,4]。鑒于此，本研究從河南省肉牛屠宰場(chǎng)中采集病料進(jìn)行了牛支原體分離鑒定，旨在對(duì)河南省牛支原體的流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查，為牛支原體的診斷、疫苗的研制開發(fā)以及牛支原體病的綜合防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 病料與毒株

于2019年12月，從河南省某肉牛屠宰場(chǎng)采集肺等病料共計(jì)320份。樣品低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。牛支原體HB0801株，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)郭愛珍教授惠贈(zèng)。

1．2 主要試劑

PPLO肉湯粉、TSA（Tryptic Soy Agar，胰蛋白大豆瓊脂），購自BD有限公司；酵母粉、瓊脂粉，購自美國BD公司；葡萄糖、酚紅，購自上海國藥集團(tuán)公司；MEM、馬血清，購自Hyclone公司；青霉素，購自華北制藥集團(tuán)公司；精氨酸，購自Roche公司；2×Direct PCR Mix、Hot Start Taq酶、Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1．3 培養(yǎng)基的配制

PPLO液體培養(yǎng)基：PPLO肉湯粉10.5g、葡萄糖2.5g、酵母粉2.5g，溶于440mL超純水中，115℃滅菌15min，加MEM 5mL、馬血清50mL、8萬單位青霉素5mL、10%精氨酸10mL和1% 酚紅500μL。PPLO固體培養(yǎng)基：含1.5% 瓊脂粉的PPLO液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基于115℃滅菌15min后，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4 引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中牛支原體16S rRNA基因設(shè)計(jì)1對(duì)通用引物，用于牛支原體的擴(kuò)增。上游引物P1：5’-CCTTAGGCAGTTTCTTTATAA-3’，下游引物P2：5’-CATGCATGTCGAGCGATGAT-3’， 預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段1 390bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1．5 牛支原體的分離培養(yǎng)

將無菌條件下采集的肺組織切成小塊，加入2mL PBS，碾磨后將上清以5 000r/min離心3min，然后用0.45μm濾膜過濾，加入到有酚紅的PPLO液體培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～5d后，轉(zhuǎn)接至PPLO液體培養(yǎng)基傳代，直至液體顏色由紅色變?yōu)辄S色，取100μL涂布PPLO固體培養(yǎng)基表面，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～5d后，肉眼觀察生長(zhǎng)情況并在低倍顯微鏡下觀察固體培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)，吉姆薩染色，油鏡下觀察菌體形態(tài)。

1．6 牛支原體的鑒定

將疑似支原體菌落接種PPLO液體培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色時(shí)，收集菌體，用DNA提取試劑盒提取DNA，分別用P1、P2擴(kuò)增并測(cè)序鑒定。以牛支原體HB0801株為陽性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2．1 牛支原體的分離培養(yǎng)

肺組織培養(yǎng)3～5d、傳代1～3代后，PPLO液體培養(yǎng)基逐漸變黃，PPLO平板上肉眼可見極小的針尖狀菌落，低倍顯微鏡下觀察固體培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)，為多樣并有典型的支原體“煎荷包蛋樣”（圖1）。吉姆薩染色，油鏡下觀察支原體菌體形態(tài)，為多形態(tài)，呈球菌樣、彎曲的絲狀、螺旋狀（圖2）。320份病料中形態(tài)上疑似為牛支原體的共計(jì)97株。

圖1 牛支原體菌落顯微鏡下形態(tài)

圖2 牛支原體菌體吉姆薩染色顯微鏡下形態(tài)

2．2 牛支原體的PCR鑒定結(jié)果

將97株疑似牛支原體菌體提取DNA擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序有15株與牛支原體 HB0801-P180株（GenBank No：CP007591）同源性在98%以上。證明所分離的15株毒株為牛支原體，其余經(jīng)鑒定均為無膽甾原體或精氨酸支原體等。

圖3 牛支原體PCR鑒定結(jié)果

結(jié)合以上結(jié)果，共從320份病料中分離鑒定出15株牛支原體，分離率達(dá)4.68%。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)于2019年12月在河南省某肉牛屠宰場(chǎng)采集肺等樣品共計(jì)320份，分離出疑似支原體97株，鑒定結(jié)果有15株為牛支原體。

由于牛支原體與其他支原體和無膽甾原體形態(tài)上非常相似，難以區(qū)分，故在進(jìn)行支原體培養(yǎng)時(shí)，分離出97株形態(tài)類似的菌體，通過測(cè)序比對(duì)，發(fā)現(xiàn)大多為無膽甾原體、精氨酸支原體等。這些不致病的病原在形態(tài)上與牛支原體很難區(qū)分，只有通過測(cè)序才能將其鑒定出，最后從320份樣品中分離鑒定出15株牛支原體。在屠宰場(chǎng)中看似健康的成年肉牛感染率也是較高的，有相當(dāng)一部分肺臟樣品表現(xiàn)不同程度的肉樣實(shí)變。因此，分離的病原均為牛支原體，而不是絲狀支原體或其他支原體。

2008年以來我國多數(shù)地區(qū)均報(bào)道有牛支原體的感染情況[5～12]，而河南省牛支原體的報(bào)道相對(duì)較少[13～15]，本研究對(duì)河南省肉牛屠宰場(chǎng)的支原體進(jìn)行了分離鑒定，從結(jié)果看，河南省牛支原體在屠宰場(chǎng)的感染情況十分嚴(yán)重，陽性率高達(dá)4.68%。對(duì)屠宰場(chǎng)牛支原體的感染應(yīng)當(dāng)引起足夠的重視。應(yīng)加強(qiáng)屠宰場(chǎng)的管理和檢疫，以防止本病的擴(kuò)散和蔓延。