李澤萱 杜蕓輝 黃 鑫 李思懿 王 曉 聶紹平

阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea，OSA)是一種常見的睡眠呼吸障礙，其特點是睡眠過程中上氣道完全或部分阻塞導(dǎo)致反復(fù)呼吸暫停和/或呼吸淺慢。 OSA 引起心血管損害的主要機(jī)制是慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)。然而，OSA 對于心肌梗死急性期的心肌損傷是否存在影響目前仍存在爭議。 有研究顯示，在非致命性心肌梗死患者中，OSA 可能通過缺氧預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)心肌形成微血管從而減輕心肌損傷[1-2]。 C1q 腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白9(CTRP9)是一類與脂聯(lián)素高度同源的脂肪因子[3]。 既往研究顯示，缺血性心肌損傷后血漿CTRP9 水平下降，在CTRP9 水平升高或降低的情況下，心肌梗死的面積可以相應(yīng)的減小或增大[4]。 本研究通過觀察在CIH 暴露下，小鼠心肌梗死急性期CTRP9 的表達(dá)及心功能的變化，以評價OSA 對心肌梗死急性期心肌損傷的作用。

材料與方法

1.研究材料 (1)實驗動物 選取健康SPF 級雄性C57BL/6 WT 小鼠，6 ～8 周齡，體質(zhì)量(25±3)g，購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。 實驗動物在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院實驗動物房內(nèi)正常飼養(yǎng)，動物房內(nèi)溫度控制在23 ～26 ℃，相對濕度控制在60%，環(huán)境安靜、通風(fēng)干燥，晝夜節(jié)律12 h 循環(huán)，動物自由攝取水和無菌飼料，符合實驗動物倫理委員會的要求。

(2)主要實驗試劑 蛋白定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于賽默飛世爾科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq II 購于日本TAKARA 公司；GAPDH多克隆抗體購于北京中杉金橋公司；CTRP9 多克隆抗體購于美國Aviscerbabio Science 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購于美國Licor 公司；小鼠血漿的CTRP9 ELISA 試劑盒購于南京建成生物工程研究所有限公司；MASSON 三色染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。

2.方法 (1)動物分組 按照隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為低氧組(CIH， n ＝18) 和常氧組(NOR， n ＝18)。 CIH 組小鼠在低氧艙中飼養(yǎng)28 d后，接受心臟左冠狀動脈前降支結(jié)扎手術(shù)，術(shù)后再次暴露于CIH 環(huán)境3 d(CIH-MI 3 d，n ＝6)、7 d(CIHMI 7 d， n ＝6)和14 d(CIH-MI 14 d，n ＝6)。 NOR 組小鼠于正常環(huán)境中飼養(yǎng)28 d 后，接受心臟左冠狀動脈前降支結(jié)扎手術(shù)，術(shù)后再次于正常環(huán)境中飼養(yǎng)3 d(NOR-MI 3 d，n ＝6)、7 d(NOR-MI 7 d， n ＝6)和14 d(NOR-MI 14 d，n ＝6)。

(2) 干預(yù)方法 采用 OxyCycler A84(BioSpherix，USA)動態(tài)編程三氣動物培養(yǎng)箱建立CIH 模型。 將CIH 組小鼠放入培養(yǎng)箱內(nèi)，由電腦軟件按照設(shè)定的氣體濃度-時間曲線使艙內(nèi)氧氣濃度6%～21%之間循環(huán)。 CIH 組小鼠每天在培養(yǎng)箱內(nèi)8 h，持續(xù)28 d，艙內(nèi)溫度、濕度與室內(nèi)相同。 NOR 組放于常氧環(huán)境中，干預(yù)時間與CIH 組相同。

(3)動物模型制備 提前對全部小鼠進(jìn)行左胸部脫毛處理，使小鼠在3.0%異氟烷吸入麻醉后取仰臥位，頭部和四肢固定于手術(shù)臺上，使用呼吸麻醉機(jī)維持麻醉狀態(tài)，于胸骨左緣捫及心臟搏動處縱行切開皮膚，然后逐層鈍性分離肋間肌肉，于第四肋間打開胸腔，拇指食指輕微用力將心臟擠出胸腔。 以左心耳下緣為標(biāo)志，左心耳根部下2 ～3 mm 用6-0無創(chuàng)縫線穿過左冠狀動脈前降支，進(jìn)針深度0.5 mm，術(shù)中可見結(jié)扎線以下心肌顏色變白，可初步認(rèn)為心肌梗死建模成功，即可將心臟送回胸腔內(nèi)。 最后，用3-0 無創(chuàng)縫線常規(guī)結(jié)扎關(guān)閉胸腔。 將麻醉狀態(tài)解除后查看小鼠能否自主呼吸。 小鼠術(shù)后注意保溫，避免搬動，待其清醒。

表1 各組小鼠心臟多普勒超聲檢測結(jié)果的比較

表1 各組小鼠心臟多普勒超聲檢測結(jié)果的比較

注:與MI 3 d 組比較，*P＜0.05；與MI 7 d 組比較，＃P＜0.05

NOR項目MI 3 d(n＝6)MI 7 d(n ＝6)MI 14 d(n ＝6)CIH F 值 P 值MI 3 d(n ＝6)MI 7 d(n ＝6)MI 14 d(n ＝6)F 值 P 值LVIDd/mm 3.6 ±0.2 4.0 ±0.7 4.9 ±0.3*＃ 10.721 0.001 3.3 ±0.3 4.4 ±0.2* 5.2 ±0.2*＃ 76.806 0.000 LVIDs /mm 3.4 ±0.3 3.5 ±0.6 4.4 ±0.3*＃ 10.510 0.001 2.6 ±0.3 4.3 ±0.3* 4.9 ±0.3*＃ 90.852 0.000 LVPWd /mm 1.5 ±0.4 1.6 ±0.6 1.8 ±0.5 0.352 0.709 1.3 ±0.4 1.8 ±0.6 2.0 ±0.7* 2.513 0.562 LVPWs /mm 1.7 ±0.4 1.9 ±0.6 2.0 ±0.4* 0.549 0.589 1.4 ±0.4 2.2 ±0.5* 2.2 ±0.9* 3.286 0.605 FS/% 17.1 ±2.7 13.7 ±0.8* 10.4 ±1.6*＃ 19.893 0.000 21.2 ±3.3 14.2 ±1.5* 9.7 ±0.5*＃ 46.478 0.000 LVEF/% 37.3 ±5.3 29.2 ±1.6* 22.8 ±3.3*＃ 22.891 0.000 45.3 ±4.8 30.8 ±3.1* 21.3 ±0.9*＃ 78.459 0.000

圖2 CIH 和NOR 組小鼠冠狀動脈結(jié)扎后3 d 的心臟多普勒超聲檢測結(jié)果注:與NOR 組比較，*P＜0.05；與NOR 組比較，**P＜0.01

(4) 心臟多普勒超聲檢測 采用實驗動物房VisualSonics Vevo 2100 型超聲儀對小鼠進(jìn)行心臟多普勒超聲測量。 將小鼠稱重后麻醉左胸前脫毛，固定于操作臺，調(diào)整探頭角度以獲得左心室的長軸切面，然后將探頭順時針轉(zhuǎn)動90°，獲得左心室短軸的各個切面。 數(shù)值取測量三個心動周期的平均值。

(5) MASSON 染色 麻醉并固定動物，剪開胸腔，充分暴露心臟，剪開右心耳，用0.9%氯化鈉液經(jīng)心尖灌流至肝臟組織發(fā)白后，剪下心臟，置4%的多聚甲醛溶液中24 h 固定，包埋后切成厚度約5 μm 的石蠟切片，脫水并進(jìn)行MASSON 染色。 鏡下可見膠原纖維成分呈藍(lán)色，正常心肌呈紅色。

(6) Western blot 法檢測小鼠心肌CTRP9 蛋白表達(dá)水平 提取小鼠心肌組織蛋白，冰上裂解，制備心臟組織勻漿，離心后取上清液存于EP 管中。 采用BCA 法測定蛋白濃度，加裂解液保存于-80 ℃冰箱備用。 進(jìn)行SDS-PAGE 后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。 用5% BSA 封閉1 h 后，孵育相應(yīng)一抗4 ℃慢搖過夜，恢復(fù)室溫后，TBST 清洗，室溫慢搖1 h 孵育二抗，膠片發(fā)光，并用Image 分析軟件進(jìn)行各條帶吸光度值計算。 目的蛋白均與GAPDH 蛋白校準(zhǔn)。

(7) RT-PCR 法檢測小鼠心肌CTRP9 mRNA 的水平 取各組小鼠心臟，用TRIzol 提取心肌的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將每組2 mg 的總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。 把反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋1 倍，利用熒光定量PCR 儀進(jìn)行PCR 反應(yīng)。 每個樣品設(shè)3 個復(fù)孔。目的基因均與GAPDH 基因的表達(dá)進(jìn)行校準(zhǔn)。

(8) ELISA 法檢測小鼠血漿CTRP9 濃度 心臟取材前，用經(jīng)肝素潤管的注射器在心尖搏動最強(qiáng)處進(jìn)針，由于心臟跳動使血液泵入注射器，可取約1 mL 血液，并立即在4 ℃下離心，后將血漿冷凍在-80 ℃下進(jìn)行后續(xù)測定，避免重復(fù)凍融循環(huán)。 使用ELISA 試劑盒通過夾心法測定血漿CTRP9 濃度。樣品一式兩份進(jìn)行測定。

3.統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計軟件SPSS 25.0 和GraphPad 7.0 軟件處理。 計量資料均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較用非配對t 檢驗；多組之間的比較用多因素方差分析。 計數(shù)資料以頻數(shù)(率)表示。 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.各組小鼠心臟多普勒超聲檢測 結(jié)果顯示，在冠狀動脈結(jié)扎3、7、14 d 后，CIH 組和NOR 組小鼠的舒張期左心室后壁厚度(LVPWd)和收縮期左心室后壁厚度(LVPWs)均無顯著改變。 兩組小鼠的LVIDd 和LVIDs 均逐漸增加(均P ＜0.001)，LVEF 和短軸縮短分?jǐn)?shù)(FS)均逐漸減少(均P ＜0.001)，提示小鼠左心室擴(kuò)張、心功能減低(圖1，表1)。 此外，冠狀動脈結(jié)扎術(shù)后3 d，CIH 組小鼠的LVEF 和FS 均顯著高于NOR 組(均P ＜0.05)，LVIDs 明顯低于NOR 組(P＜0.01)。 LVIDd 和左心室后壁厚度無顯著改變(圖2)。

2.各組小鼠心肌纖維化程度 在冠狀動脈結(jié)扎術(shù)后3 d，CIH 組小鼠心肌纖維化的面積比例明顯小 于 NOR 組[(0.79 ± 0.0016)% vs.(4.48 ±0.0167)%，P＜0.001，圖3]。

3.各組小鼠心肌組織CTRP9 表達(dá)水平 在CIH 組和NOR 組中均可觀察到相較于MI3d 組，MI7d 組CTRP9 的蛋白表達(dá)水平均上調(diào)(CIH: P＜0.05；NOR: P＜0.01)。 在MI 3 d 時可發(fā)現(xiàn)，CIH 組小鼠心肌組織的CTRP9 蛋白表達(dá)水平高于NOR 組(P＜0.05，圖4)。 小鼠心肌組織中CTRP9 mRNA 的表達(dá)水平也發(fā)現(xiàn)了同樣的規(guī)律，MI7d 組小鼠的CTRP9 mRNA 水平高于MI3d 組(CIH: P ＜0.05；NOR: P＜0.01)， 可能預(yù)示著心肌損傷嚴(yán)重程度從心肌梗死后急性期到亞急性期或愈合期的恢復(fù)。 此外，在MI 3 d 時CIH 組小鼠心肌組織的CTRP9 mRNA 表達(dá)水平也高于NOR 組(P＜0.05，圖5)。

4.各組小鼠血漿CTRP9 濃度 冠狀動脈結(jié)扎術(shù)后7 d，CIH 組和NOR 組小鼠的血漿中CTRP9 的濃度均高于冠狀動脈結(jié)扎術(shù)后3 d(CIH: P＜0.05；NOR: P＜0.01)。 在心肌梗死急性期時，CIH 組小鼠的血漿CTRP9 濃度高于NOR 組(P＜0.01)，圖6。

圖3 小鼠冠狀動脈結(jié)扎后3 d 的Masson 染色 A:CIH 組，B:NOR 組

圖4 各組小鼠心肌組織中CTRP9 蛋白表達(dá)水平 A:各組心臟中GADPH 和CTRP9 的表達(dá)水平；B:各組心臟中CTRP9/GADPHA 的量化結(jié)果注:與NOR＋MI 3 d 組比較， *P＜0.05；與NOR＋MI 3 d 組比較， **P＜0.01；與CIH＋MI 3 d 組比較，＃P＜0.05

圖5 各組小鼠心肌組織中CTRP9 mRNA 表達(dá)水平 注:與NOR＋MI3d 組比較， *P＜0.05；與NOR＋MI 3 d 組比較，**P＜0.01；與CIH＋MI 3 d組比較，＃P＜0.05

圖6 各組小鼠血漿中CTRP9 濃度 注: 與NOR＋MI 3 d 組比較，**P ＜0.01；與CIH＋MI 3 d 組比較，＃P＜0.05

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，與NOR 干預(yù)相比，在結(jié)扎冠狀動脈前后均進(jìn)行CIH 干預(yù)的小鼠心肌纖維化面積顯著減少、LVEF 明顯提高，主要體現(xiàn)在心肌梗死后3 d。 此外，在心肌梗死急性期，CIH 組小鼠心肌組織和血漿中的CTRP9 水平顯著升高。 本研究提示CTRP9 可能參與CIH 在心肌梗死急性期的保護(hù)作用。

OSA 是一種常見的睡眠呼吸障礙，多發(fā)于肥胖人群，并且與心血管疾病密切相關(guān)。 一項多中心臨床研究證實，在全球范圍內(nèi)有約9.36 億成年人患有輕度至重度OSA，其中4.25 億為中度至重度OSA，而中國則是患病率最高的國家[5]，在急性冠狀動脈綜合征患者中的患病率達(dá)54%～69%[6]。 OSA 可以通過多種病理生理學(xué)因素來參與心血管疾病的發(fā)生，包括CIH、睡眠片段化和胸內(nèi)壓力波動，從而導(dǎo)致心臟和肺血管血流動力學(xué)改變[7]。 大量臨床研究證實，OSA 可引起亞臨床心肌損傷，是遠(yuǎn)期心功能不全和死亡的危險因素[8-9]。 但是一些基礎(chǔ)實驗發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死急性期缺氧預(yù)適應(yīng)可能對心臟保護(hù)產(chǎn)生正面影響，可能與側(cè)支循環(huán)的形成、激活心肌細(xì)胞自噬或與增強(qiáng)抗氧化酶表達(dá)有關(guān)[2，10]。 例如，Estrada 等[11]對狗進(jìn)行了為期20 d 的間歇性低氧訓(xùn)練后(每天5～8 次，每次持續(xù)5～10 min 中度低氧，4 min 的常氧暴露)，將左冠狀動脈前降支閉塞60 min，然后再灌注5 h。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)CIH 使心肌梗死面積從(41±5)%急劇降低至(1.8±0.9)%(P ＜0.001)。 類似的，在Béguin 等[12]實驗中，經(jīng)過CIH預(yù)處理的大鼠，在隨后的缺血-再灌注損傷中心肌梗死面積明顯減小。 Chang 等[10]的研究結(jié)果表明，于每30 min 氧氣濃度在5%～20%之間循環(huán)的環(huán)境中培養(yǎng)大鼠原代心肌細(xì)胞，可以發(fā)現(xiàn)CIH 可以通過上調(diào)抗氧化酶的作用，保護(hù)心肌細(xì)胞免受H2O2-和缺血-再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡。 以上研究表明，短暫暴露于輕度CIH 可以保護(hù)心臟免受更嚴(yán)重的缺氧和局部缺血的影響，即心臟可以適應(yīng)短暫的、適當(dāng)深度的間歇性低氧反應(yīng)，增強(qiáng)心肌對后續(xù)更嚴(yán)重缺血性事件的耐受性，從而發(fā)揮心臟保護(hù)作用[13]。 在本研究中，可能由于永久性高位結(jié)扎冠狀動脈對小鼠心肌造成的缺血損傷更為嚴(yán)重，所以僅在心肌梗死急性期觀察到明顯的缺氧預(yù)適應(yīng)對心功能的改善作用。

CTRP9 屬于脂聯(lián)素旁系同源的CTRP 家族，較脂聯(lián)素在心肌組織中的表達(dá)更為顯著，可以參與調(diào)控與肥胖相關(guān)的代謝紊亂或心血管疾病[14]。 Zhao等[15]在CTRP9 敲除小鼠模型中探索了心源性CTRP9 在心肌損傷中的作用。 小鼠體外模擬缺血/再灌注后，心臟CTRP9 的表達(dá)下降，而其過表達(dá)則改善了左心功能不全和心肌細(xì)胞凋亡。 在非酒精性脂肪肝模型中，CTRP9 通過AMPK 調(diào)控自噬抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕了肝脂肪變性，減少細(xì)胞凋亡[16]。CTRP9 主要通過促進(jìn)AMPK 磷酸化抑制心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心臟保護(hù)作用，AMPK 活性的阻斷消除了CTRP9 對心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用[17]。 本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過CIH 干預(yù)的小鼠在心肌梗死的急性期內(nèi)，心臟保護(hù)因子CTRP9 的表達(dá)較NOR 組更多。 這可能是由于CIH 組發(fā)生缺氧預(yù)適應(yīng)，使心肌CTRP9 表達(dá)增多，通過激活A(yù)MPK 依賴的自噬過程，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減少心肌梗死面積，改善心功能。

綜上所述，CIH 干預(yù)在心肌梗死急性期可能發(fā)揮心臟保護(hù)作用，表現(xiàn)為梗死面積減少及心功能改善。 CTRP9 可能在CIH 保護(hù)心肌損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。 仍需進(jìn)一步研究CTRP9 參與CIH 改善心肌損傷中的作用機(jī)制。