王章存 劉 洋 安廣杰 胡金強 趙學偉 賀志錚

(鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院1，鄭州 450001)(河南省食品安全國際聯(lián)合實驗室2，鄭州 450001)

大豆蛋白是食品工業(yè)中常用的植物蛋白。但大豆也是國際公認的八大過敏原食物之一，可引起人體腹瀉、皮疹、咽喉水腫和急性哮喘等癥狀[1]，影響了大豆蛋白的食用價值。大豆中的致敏成分均是蛋白質(zhì)，目前在大豆中發(fā)現(xiàn)有38種蛋白質(zhì)具有致敏現(xiàn)象。大豆中的儲藏蛋白也是主要的致敏蛋白，其中大豆β-伴球蛋白是大豆中最重要的一種抗原蛋白[2]。該蛋白是由α′(57～83 ku)、α(57～76 ku)和β(42～53 ku)3種亞基組成的分子質(zhì)量為150～210 ku的三聚體，其聚合形式包括ααα、ααα′、αα′β、ααβ、αββ、α′ββ等)[3]。常規(guī)的食品加熱和酶解處理難以消除大豆β-伴球蛋白的抗原活性[4-7]，但酶解處理相較而言是更有效的手段，能在顯著降低大豆蛋白抗原性的同時提高蛋白的多種功能特性如溶解性、乳化性、發(fā)泡性等[8，9]，風味蛋白酶是蛋白質(zhì)酶解時常用的酶制劑之一，與其它酶制劑相比，其特點是可以從肽鏈羧基末端切除氨基酸，在去除苦味，改善口感的同時，還能提高蛋白有效利用率并降低生產(chǎn)成本。此外有研究表明糖基化反應能通過大豆蛋白與糖結(jié)合后發(fā)生結(jié)構(gòu)變化降低蛋白抗原性[10]。β-伴球蛋白是含糖量約為5%的糖蛋白[11]，其3個亞基被N-糖鏈所修飾[12]，它們富含甘露糖[13]。糖基化修飾蛋白質(zhì)不僅影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、生物活性、運輸和定位，而且在分子識別、細胞通信、信號轉(zhuǎn)導等特定生物過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[14,15]，而β-伴球蛋白中的糖組分在其致敏反應中的地位和作用是目前研究的重要內(nèi)容[16,17]。本研究通過β-伴球蛋白脫糖前后及其在酶解過程中蛋白質(zhì)分子成分和抗原性的變化，研究糖鏈對β-伴球蛋白的抗原活性的影響及其在酶解過程中的作用，為有效降低或消除大豆蛋白的抗原性提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大豆β-伴球蛋白(參考Nagano方法[18]實驗室自制，純度約92%)，風味蛋白酶，N-糖苷酶PNGase F，大豆β-伴球蛋白酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒，標準分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，考馬斯亮蘭R250，其它化學試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式磁力攪拌器，DYY-7C 型電泳儀，DYCZ-24DN型電泳槽，iMark酶標儀，F(xiàn)D-1A-50冷凍干燥機，UV-8100B紫外-可見分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 β-伴球蛋白的脫糖基化

參照Amigo-Benavent方法[17]釋放N-糖鏈。主要步驟：取β-伴球蛋白凍干樣品每8 mg溶于800 μL蛋白變性液(0.4 mol/L DTT, 5% SDS)，于沸水中加熱10 min。待樣品冷卻至室溫后，加入80 μL的磷酸緩沖液(0.5 mol/L, pH 7.5), 80 μL的NP-40(10%)和8 μL的PNGase F溶液，于37 ℃恒溫酶解24 h后100 ℃水浴加熱10 min滅酶。之后將樣品用Sep-Park C18微柱將糖和蛋白質(zhì)分離。

1.3.2 糖含量分析

苯酚-硫酸法測定。參考張惟杰方法[19]進行。主要過程，樣品1.0 mL、6%苯酚0.5 mL、濃硫酸5.0 mL，混勻后并在室溫靜置10 min后，于490 nm處測定光吸收值。以葡萄糖為標準品制作工作曲線。

1.3.3 β-消去反應判斷糖蛋白質(zhì)O-連接

參考文獻[20]方法。主要步驟是：將大豆β-伴球蛋白溶解在0.1 mol/L NaOH溶液，并于45 ℃保溫18 h。反應結(jié)束后，冷卻至室溫，于220～270 nm進行光譜掃描。對照樣品用水處理。比較兩種樣品在240 nm處光譜變化。

1.3.4 脫糖和原始β-伴球蛋白的酶解

β-伴球蛋白的酶解：將β-伴球蛋白配制成5 mg/mL的溶液，按1.3.1方法加入蛋白變性液并沸水浴加熱10 min。冷卻水溫至55 ℃后，用2 mol/L的HCL溶液調(diào)節(jié)pH 6.5，按照酶與蛋白質(zhì)比例1∶100(E/S)加入風味蛋白酶，磁力攪拌器恒溫攪拌下酶解反應；在酶解0、10、30、60、90、120、150、180 min時分別吸取100 μL酶解液于離心管，立即置于100 ℃水浴加熱10 min終止酶解反應。然后樣品于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

脫糖后β-伴球蛋白也按上述相同的方法和條件酶解、取樣和保存。

1.3.5 SDS-PAGE分析

根據(jù)Laemmli[21]的方法，采用不連續(xù)垂直SDS-PAGE系統(tǒng)。分離膠質(zhì)量分數(shù)為12%，濃縮膠質(zhì)量分數(shù)為5%，上樣量為15 μL。濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓110 V。考馬斯亮藍R250染色，脫色后拍照。

1.3.6 酶解產(chǎn)物抗原活性測定

采用競爭法大豆β-伴球蛋白ELISA試劑盒測定。樣品用純水稀釋50倍后，按照試劑盒說明書的步驟操作，在酶標儀中測定β-伴球蛋白標準品和測試樣品的OD值。每份樣品重復三次。以標準品的工作曲線計算樣品測定結(jié)果。數(shù)據(jù)采用ORIGIN 8.0軟件處理。以未酶解原β-伴球蛋白的抗原活性為基數(shù)，計算脫糖和未脫糖樣品及其酶解產(chǎn)物的抗原活性剩余率，即：抗原活性剩余率=(樣品抗原活性÷原β-伴球蛋白抗原活性)×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆β-伴球蛋白的脫糖效果分析

糖與苯酚-硫酸反應的產(chǎn)物有特征性光吸收特征，在490 nm處有最大吸光值。根據(jù)此原理，將脫糖前后的β-伴球蛋白經(jīng)硫酸-苯酚反應后的光吸收曲線如圖1所示?？梢钥闯觯?伴球蛋白的反應產(chǎn)物在490 nm處吸光值較高，脫糖后的β-伴球蛋白吸光值很低，表明糖苷酶起到了較好的脫糖效果。

圖1 脫糖前后β-伴球蛋白與苯酚-硫酸反應物光吸收特征

為了進一步驗證β-伴球蛋白經(jīng)脫糖酶PNGase F處理后脫下的糖含量，將脫糖樣品經(jīng)苯酚-硫酸反應后，并用葡萄糖為標準品制作工作曲線，測定結(jié)果換算為β-伴球蛋白含糖量為(4.13±0.6)%，與文獻中報道的含糖量5%的結(jié)果接近[11]。需要說明的是，關(guān)于大豆β-伴球蛋白含糖量的文獻報道極少，而且除了N—連接的糖鏈外，還含有O—連接糖成分[22]。

為了進一步確定大豆β-伴球蛋白O—糖鏈的存在，本研究通過β-消去反應分析反應前后蛋白質(zhì)樣品光吸收特征(圖2)?？梢娊?jīng)β-消去反應后，大豆β-伴球蛋白在240 nm處凸起一個明顯的峰，表明大豆β-伴球蛋白中含有O-糖肽鍵。本研究僅采用PNGase F酶特異地切除糖蛋白中的N—糖肽鍵，它可以在釋放N—糖鏈的同時保持蛋白質(zhì)肽鏈的完整性。

圖2 大豆β-伴球蛋白經(jīng)β-消去反應前后的光吸收曲線

2.2 脫糖前后β-伴球蛋白組分在酶解過程中的變化

將脫去N-糖鏈的大豆β-伴球蛋白和原β-伴球蛋白分別在相同的條件下，用風味蛋白酶水解，將不同酶解時間的產(chǎn)物做SDS-PAGE，結(jié)果如圖3所示。

a 未脫糖β-伴球蛋白酶解物 b 脫糖β-伴球蛋白酶解物

從圖3可知，脫糖與未脫糖β-伴球蛋白的酶解產(chǎn)物的電泳行為有顯著差異：原β-伴球蛋白α-、和α′-亞基在酶解的初始階段很快消失，β-亞基在持續(xù)酶解180 min內(nèi)變化不大，酶解時新生成了25 ku組分，在延長酶解時間過程中，這些新成分也難以消失。這種現(xiàn)象與文獻中報道的用堿性蛋白酶、胃蛋白酶水解時的結(jié)果相似[7,23]。

脫糖后的β-伴球蛋白在酶解的前10 min時就幾乎完全消失，同時新生成了約37、33 ku的肽鏈，酶解90 min時又新生成25 ku組分。而原β-伴球蛋白酶解過程中沒有產(chǎn)生37、33 ku組份。Amigo-Benavent等[17]研究發(fā)現(xiàn)，用胃腸液酶解2 h后，原β-伴球蛋白β-亞基仍然存在，而脫糖后的β-伴球蛋白β-亞基則完全消失。但該文獻沒有考查不同酶解時間條件下兩種蛋白質(zhì)譜帶的變化規(guī)律。以上結(jié)果表明，β-伴球蛋白中糖鏈的存在，影響蛋白酶的水解行為。

2.3 脫糖與未脫糖β-伴球蛋白酶解過程中的抗原性變化

根據(jù)圖4可看出，β-伴球蛋白經(jīng)過脫糖處理后，其抗原活性明顯降低，僅有原β-伴球蛋白抗原活性的60.1%。此結(jié)果表明，β-伴球蛋白中的糖成分對其抗原活性有很大的貢獻。

圖4 酶解過程中原始與脫糖β-伴球蛋白的抗原活性剩余率

β-伴球蛋白酶解反應前期抗原活性降低幅度較大，酶解90 min下降為57.0%，此階段也是α′-和α-亞基條帶逐漸消失的時間(圖3)，這一階段抗原活性的降低，可能是由于α′、α亞基被酶解后，其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，構(gòu)象表位遭到破壞，也可能有序列型抗原表位被破壞，從而降低了其抗原活性。在90～180 min時，抗原活性下降的趨勢有所減弱，180 min時抗原活性剩余43.4%，可能是隨著構(gòu)象表位的減少，酶與抗原蛋白的結(jié)合位點也隨之減少、酶解速率下降，減小了抗原活性的下降幅度。這種變化趨勢與文獻中的研究結(jié)果相似[3,24]。

脫糖后的β-伴球蛋白酶解過程中抗原性的變化行為與原β-伴球蛋白也有明顯不同。雖然隨著酶解時間的延長其抗原性逐漸降低，但沒有明顯的斷崖式降低現(xiàn)象，酶解180 min后抗原活性剩余25.0%。這表明與糖鏈存在有相關(guān)性。此結(jié)果不僅支持文獻[25]中β-伴球蛋白去糖基化后與其IgE抗體特異性結(jié)合的活性降低或消失的結(jié)論，而且也證明蛋白質(zhì)脫糖后酶解行為與酶解產(chǎn)物的抗原活性的變化有直接關(guān)系。關(guān)于β-伴球蛋白中糖與蛋白的連接位點、糖鏈成分、結(jié)構(gòu)信息及其影響酶解和抗原性的機制有待于進一步深入研究。

3 結(jié)論

用PNGase F酶可以有效脫除大豆β-伴球蛋白中N-糖肽鍵，但β-消去反應證明該蛋白質(zhì)中還有O-連接糖成分；脫糖后的蛋白抗原活性顯著降低；脫去N-糖鏈前后的β-伴球蛋白在風味蛋白酶水解過程中，其亞基組分和抗原性的變化趨勢具有明顯差異。結(jié)果表明N-連接糖組分的存在是β-伴球蛋白具有抗原性的重要因素。