韓振坤，姜素文，吳霄迪

0 引言

對氧磷酶(Paraoxonase,PON)是一類能催化水解磷酸酯鍵的芳香酯酶，它既可水解有機磷酸酯、芳香羧酸酯及氨基甲酸酯等多種物質(zhì)，又可減少過量過氧化物、氧化型磷脂的生成。PON1是其中發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的一個成員,普遍存在于哺乳動物中，其中以肝臟及血液中活性最高。PON1能夠水解有機磷的毒性代謝衍生物，是有機磷中毒預(yù)防和治療的新途徑。PON對有機磷酸酯毒性具有重要的保護作用，這種保護作用主要通過肝臟和血漿中的PON1對有機磷農(nóng)藥以及神經(jīng)毒性物質(zhì)的水解而發(fā)揮作用。本文對PON與有機磷農(nóng)藥中毒的關(guān)系及研究進展進行綜述。

1 PON的生物學(xué)特性

1.1 生理、化學(xué)特征 PON為含255個氨基酸的蛋白物質(zhì)，分子量為43～45 kD。PON中含有4個糖鏈，糖類占整個分子質(zhì)量15.8%，除去糖后，酶蛋白分子量約為37 kD。PON存在于多種微生物、昆蟲、鳥類及哺乳動物的體內(nèi)，在哺乳動物中對氧磷酶主要由肝臟分泌，并廣泛分布于多種組織，其中肝臟和血液中對氧磷酶活力最高。PON中氨基酸末端成分中有豐富的氨基酸殘留基，在血清中主要與高密度脂蛋白(HDL)結(jié)合，形成顆粒狀同源八聚合體結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)稱作人類磷酸鹽結(jié)合蛋白(HPBP)，是人類PON的天然伴侶，具有較高的生物學(xué)穩(wěn)定性。研究表明，PON的活性和穩(wěn)定性在很大程度上依賴HDL的分子環(huán)境，其中HPBP起到了非常重要的作用[1-2]。

1.2 PON的基因多態(tài)性 人類對氧磷酶是多基因家族，根據(jù)基因分布不同可分為PON1、PON2、PON3 3種高度同源的類型。在PON 3種類型中，只有PON1具有降解有機磷作用，其他類型PON具備抗氧化等能力。

人類PON1基因多態(tài)性主要表現(xiàn)在第192位點和第55位點上，即192谷氨酰胺(Q)/精氨酸(R)和55亮氨酸(L)/蛋氨酸(M)的變化。Mackness等[3]研究了這2種基因多態(tài)性對健康人血清對氧磷水解的影響，研究發(fā)現(xiàn)，第192位點、第55位點基因多態(tài)性和血清PON1的濃度分別占PON1活性變化的46%、13%和16%，其他參數(shù)均未顯著影響其活性。

目前的研究表明，PON1酶活性及水平是由PON1基因多態(tài)性調(diào)控的，不僅與機體基因遺傳有關(guān)，還與機體在有機磷中暴露程度和時間相關(guān)，有機磷農(nóng)藥暴露會影響人群血清PON1活性[4-5]。

1.3 PON的活性 人類PON活性在不同個體中差異較大，這種差異與基因多態(tài)性相關(guān)。不同種屬之間對氧磷酶活性差異也較大，兔血清具有較高的對氧磷酶活性，鳥類對氧磷酶活性很低。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PON在人體中的生物活性不僅與人種相關(guān)，還與肝功能、高密度脂蛋白含量、遺傳、是否吸煙等多種因素有關(guān)。

研究表明，一些藥物能夠影響酶的活性，貝特類降脂藥物和花青素可誘導(dǎo)PON1的表達，增加血清中PON1的濃度[6-7]。目前發(fā)現(xiàn)，血清PON1活性越高對有機磷毒劑的抵抗力就越強。應(yīng)用藥物調(diào)節(jié)PON1活性可能在毒理學(xué)領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價值。鑒于血清PON1水平在有機磷中毒治療中的應(yīng)用價值，基因檢測有助于識別高危個體、評估和管理慢性有機磷中毒患者[8]。

2 PON純化和其對有機磷毒性的防護作用

PON1生物活性越高，對有機磷降解速度和程度越高，有機磷中毒患者臨床表現(xiàn)越輕。目前研究認(rèn)為，PON1酶活性程度為有機磷中毒患者的保護因素。有學(xué)者通過給小鼠尾靜脈注射含有PON1基因的重組腺病毒，顯著減少了暴露于毒死蜱的小鼠全腦乙酰膽堿脂酶失活的程度，提高了血清PON1酶的水平和有機磷毒性的閾值。Fu等[9]使用裸DNA基因轉(zhuǎn)染方法，給予小鼠尾靜脈注射含有人PON1基因的真核表達質(zhì)粒，分娩后24 h PON1表達良好。在使用致死劑量的梭曼毒性研究中，注射質(zhì)粒組小鼠比對照組小鼠中毒癥狀輕，存活時間長，降低了死亡率。結(jié)果表明，通過裸DNA增加血清PON1，可以對梭曼的急性毒性提供保護。目前來看，用基因手段提高血清PON1水平預(yù)防有機磷中毒是一個可行的研究方向。

Furlong實驗室在有機磷暴露前后通過給大鼠和小鼠注射從血清純化的兔或人類PON1，結(jié)果表明，外源性PON1對有機磷中毒有顯著的保護作用，證明了PON1治療的潛在可能性，提出PON1可作為開發(fā)治療有機磷中毒的方法[10]。Furlong實驗室重組了有活性的人類PON1，并證明了對有機磷中毒的保護作用，該實驗為其設(shè)計對有機磷暴露者有充分的保護作用的PON1成為可能[11]。

對氧磷酶存在于大多數(shù)動物血清中。對兔血清PON1進行分離提純，結(jié)果表明,PON1能夠有效降低大鼠血中敵敵畏濃度，與對照組相比，PON1對敵敵畏中毒大鼠具有明顯的保護作用[12]。實驗研究中直接將純化的PON1注入動物機體中，體內(nèi)環(huán)境和免疫功能會影響PON1酶活性，為了有效保持PON1的活性，我們試驗性地制備了PON1脂質(zhì)體，初步穩(wěn)定性良好，酶活性穩(wěn)定，極大地提高了PON1在大鼠體內(nèi)的活性，并有效降低了清除率，延長了半衰期，改變了體內(nèi)對氧磷酶的藥代動力學(xué)，明顯提高了對氧磷酶體內(nèi)活性[12]，其機制有待進一步研究。

3 PON在有機磷中毒方面防治進展

傳統(tǒng)的治療有機磷中毒的方法是聯(lián)合應(yīng)用可對抗有機磷介導(dǎo)的乙酰膽堿酯酶抑制效應(yīng)的藥物和膽堿酯酶復(fù)能劑。使用原則提倡早期、足量、聯(lián)合和重復(fù)用藥。然而這些藥物治療都存在明顯的副作用，例如，在沒有膽堿能危象發(fā)生時，給予抗膽堿藥阿托品，可引起由于毒蕈堿受體阻滯導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷，如神志模糊、煩躁不安、抽搐、昏迷等。氯磷定和碘解磷定等可產(chǎn)生短暫眩暈、頭痛、血壓和心率升高及心律失常等[13]。近年來，動物實驗與臨床病例報道發(fā)現(xiàn)，作為臨床靜脈營養(yǎng)的脂肪乳可作為脂溶性藥物急性中毒的新型解毒劑[14]。脂肪乳在急性有機磷中毒患者的臨床應(yīng)用價值有待進一步研究。

當(dāng)前的研究表明,PON1在有機磷酸代謝中具有重要作用，被認(rèn)為是一個治療有機磷暴露和中毒有前途的方法。經(jīng)過多年的抗有機磷中毒治療的探索，傳統(tǒng)有機磷中毒的治療和支持療法表現(xiàn)出了其局限性。所以一直以來需要開發(fā)沒有或者不良反應(yīng)較少的藥物，這個藥物具有保護有機磷的暴露和暴露后的損傷作用。

在這種背景下，20世紀(jì)80年代末有機磷清除劑的概念形成。清除劑是在有機磷達到生理靶點時，可中和高毒的有機磷的酶或分離抗體。第一代生物清除劑是化學(xué)當(dāng)量的清除劑，為了快速有效地解除有機磷中毒，必須應(yīng)用大劑量的化學(xué)當(dāng)量清除劑。催化作用的清除劑作為第二代生物清除劑，對有機磷底物有翻轉(zhuǎn)效應(yīng)。PON1作為一種自然存在于哺乳動物血漿中具有催化活性的生物清除劑，對有機磷有天然防護作用[15-16]。

化學(xué)當(dāng)量清除劑如乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶等，一分子化學(xué)當(dāng)量乙酰膽堿酯酶結(jié)合一分子有機磷，而酶鈍化并失去了活性，為了快速有效地保護有機磷中毒，必須應(yīng)用大劑量的化學(xué)當(dāng)量清除劑。目前有研究表明，腺病毒介導(dǎo)的人丁酰膽堿酯酶活性表達持續(xù)，可保護宿主免受急性有機磷暴露[17]。而PON1作為催化作用的生物清除劑，對有機磷的清除過程是酶促水解反應(yīng)，應(yīng)用比較少的量就能產(chǎn)生相同或更大的對有機磷中毒的保護作用。因此，PON1是更有效并具有應(yīng)用前景的治療有機磷農(nóng)藥中毒的天然藥物。

目前研究較多的是應(yīng)用提純或者利用生物和蛋白工程技術(shù)合成PON1，機體免疫系統(tǒng)會對外源性蛋白產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，藥代動力學(xué)、毒理學(xué)及免疫學(xué)方面的研究資料目前較少。為解決PON1長期儲存的穩(wěn)定性、體內(nèi)運行的穩(wěn)定性和生物利用度等問題，PON1脂質(zhì)體包裹方案提供了一個較好的思路，PON1脂質(zhì)體酶活性穩(wěn)定，極大地提高了PON1在大鼠體內(nèi)的活性，并有效降低了清除率，延長了半衰期，改變了體內(nèi)對氧磷酶的藥代動力學(xué)，明顯提高了對氧磷酶體內(nèi)活性，為有機磷中毒患者的暴露和治療開辟了新的機會[12,18]。

4 結(jié)語

PON作為一類能催化水解磷酸酯鍵的芳香酯酶，其降解有機磷酸酯的作用使PON對有機磷中毒有保護作用。PON1基因多態(tài)性和農(nóng)藥暴露顯著影響人群血清PON1活性，未來基因檢測有助于識別高危個體及評估和管理有機磷暴露者。重組有活性的人類PON1在有機磷暴露者的保護和治療方面有潛在的應(yīng)用價值，如果能利用此基因重組方式生產(chǎn)大量特定基因型的PON1，用于有機磷農(nóng)藥中毒等治療，將為有機磷中毒的防治提供一種全新的安全有效的方法，預(yù)計將具有廣泛的社會應(yīng)用價值。