秦濤，汪川韋，鄭淑媚，張佳琦，朱閩，陳素娟，彭大新

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

在2010年以前，我國(guó)主要流行的是H5N1亞型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)，而2010年之后，家禽中又陸續(xù)出現(xiàn)了H5Nx亞型AIV的流行[1-3]。自2013年以來(lái)，H5N6亞型高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV)已逐漸取代H5N1亞型HPAIV成為目前我國(guó)家禽主要流行株[4-5]。另外近年來(lái)有感染人的事件發(fā)生，嚴(yán)重威脅著公共衛(wèi)生健康。疫苗接種雖能有效地控制HPAIV，但是在抗體選擇壓力下，病毒的變異速度加快，導(dǎo)致疫苗的免疫效果失敗，因此僅僅依賴疫苗并不是最有效的防控手段[6]。很多學(xué)者及從業(yè)者逐步認(rèn)識(shí)到養(yǎng)禽場(chǎng)和活禽交易市場(chǎng)的防疫核心仍然是生物安全體系的建設(shè)，其中消毒技術(shù)體系是最基礎(chǔ)但最不容忽視的環(huán)節(jié)。養(yǎng)禽場(chǎng)和活禽交易市場(chǎng)存欄禽規(guī)模較大，產(chǎn)生的糞便體量較大，特別是活禽交易市場(chǎng)，存在環(huán)境和器具等清潔不徹底導(dǎo)致糞便殘留等問(wèn)題。H5N6亞型AIV主要通過(guò)糞口途徑傳播，糞便排毒常見(jiàn)，可見(jiàn)如何保障有效殺滅家禽殘留糞便中的病毒是阻斷傳播的關(guān)鍵。但按照常用消毒劑說(shuō)明書(shū)的推薦濃度是否能有效殺滅病毒目前尚不明確。因此，本試驗(yàn)在家禽糞便環(huán)境下評(píng)估了5種常用的化學(xué)消毒劑對(duì)我國(guó)H5N6亞型HPAIV流行株的滅活效果，為科學(xué)合理地選擇養(yǎng)禽場(chǎng)和活禽交易市場(chǎng)消毒劑種類和劑量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與毒株

犬腎細(xì)胞(madin-darby canine kidney，MDCK)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中。A/Goose/Anhui/AHG0419/2016(H5N6)禽流感病毒，由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存。

1.2 主要試劑

5種消毒劑分別為：過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物、二氯異氰脲酸鈉、戊二醛癸甲溴銨、癸甲溴銨和戊二醛苯扎溴銨。按照說(shuō)明書(shū)，過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物的推薦濃度：針對(duì)AIV的使用濃度為0.062 5%，法氏囊病毒的使用濃度為0.25%，水產(chǎn)養(yǎng)殖的使用濃度為0.5%。疫源地消毒時(shí)，二氯異氰脲酸鈉的推薦使用濃度為0.2 g/L，戊二醛癸甲溴銨的推薦使用濃度為0.2%～0.1%，癸甲溴銨的推薦使用濃度為0.015%～0.05%，戊二醛苯扎溴銨的推薦使用濃度為1%。所有消毒劑使用的標(biāo)準(zhǔn)硬水(硬度342 mg/L)[7]，由氯化鎂(MgCl2·6H2O，0.139 g)和氯化鈣(CaCl2，0.034 g)加蒸餾水至1 L配制。

各消毒劑所對(duì)應(yīng)的中和劑[8]：過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物和二氯異氰脲酸鈉的中和劑為0.2 mol/L硫代硫酸鈉(國(guó)藥集團(tuán))；戊二醛癸甲溴銨的中和劑為0.1%甘氨酸(Biosharp)+0.3%吐溫80(BioFRoxx)；癸甲溴銨的中和劑為0.1%甘氨酸+0.3%吐溫80+0.03%卵磷脂(國(guó)藥集團(tuán))；戊二醛苯扎溴銨的中和劑為0.05%甘氨酸+0.4%吐溫80。

1.3 中和劑鑒定試驗(yàn)

1.3.1 中和劑及中和產(chǎn)物對(duì)H5N6亞型AIV在MDCK細(xì)胞中增殖的影響

依據(jù)衛(wèi)生部頒布的《消毒技術(shù)規(guī)范》[7]，評(píng)估糞便、中和劑及中和產(chǎn)物對(duì)病毒滴度的影響。試驗(yàn)共分為9組：第1組是消毒劑+病毒懸液；第2組是(消毒劑+病毒懸液)+中和劑；第3組是中和產(chǎn)物(消毒劑+中和劑)+病毒懸液；第4組是(硬水+病毒懸液)+中和劑；第5組是(硬水+病毒懸液)+PBS；第6組是(糞便+硬水+病毒懸液)+中和劑；第7組是(糞便+硬水+病毒懸液)+雙抗PBS；第8組是(硬水+病毒懸液)+硬水+雙抗PBS；第9組是硬水+PBS，作為不接病毒對(duì)照組。試驗(yàn)結(jié)果評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：第1組無(wú)試驗(yàn)病毒或有少量病毒；第2組較第1組為病毒稍多或相近數(shù)量，但較第3、4、5、6、7和8組顯著減少；第3、4、5、6、7和8組病毒數(shù)量與原接種量相近，第9組細(xì)胞生長(zhǎng)正常。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 病毒滅活試驗(yàn)

依據(jù)衛(wèi)生部頒布的《消毒技術(shù)規(guī)范》[7]，用標(biāo)準(zhǔn)硬水將消毒劑配制為雙倍濃度，吸取溶液0.5 mL于2個(gè)離心管中，置25℃水浴中5 min，再分別吸加0.5 mL病毒懸液(新鮮家禽糞便與尿囊液1∶1混勻后，25 ℃水浴鍋中放置30 min)，混勻并放回25℃水浴鍋。待作用一定時(shí)間(10 min、30 min、60 min)后，立即取出0.1 mL，加入含有雙抗的中和劑0.9 mL，混勻，作用30 min后，進(jìn)行10倍系列稀釋(101～108)，接種于MDCK細(xì)胞，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，病毒的半數(shù)細(xì)胞感染劑量(TCID50)按照Reed-Muench法進(jìn)行計(jì)算，平均滅活對(duì)數(shù)值按下式計(jì)算：設(shè)陽(yáng)性(病毒)對(duì)照組平均TCID50的為N0，試驗(yàn)(消毒)組平均TCID50為Nx，平均滅活對(duì)數(shù)值=lgN0-lgNx，當(dāng)平均滅活對(duì)數(shù)值=lgN0時(shí)，視為病毒完全滅活。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 中和劑及中和產(chǎn)物對(duì)病毒滴度的影響

前期研究發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)所用的4種中和劑及其中和產(chǎn)物不影響MDCK細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況[9]。采用的9組試驗(yàn)方案結(jié)果表明，含0.4 mol/L的硫代硫酸鈉雙抗PBS可以有效中和1%過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物溶液以及3.2 g/L二氯異氰脲酸鈉溶液；含0.6%吐溫80+0.06%卵磷脂+0.2%甘氨酸的雙抗PBS可以有效中和 0.24%癸甲溴銨溶液；含0.6%吐溫80+0.2%甘氨酸的雙抗PBS可以有效中和2%戊二醛癸甲溴銨溶液；含0.8%吐溫80+0.1%甘氨酸的雙抗PBS可以有效中和0.8%戊二醛苯扎溴銨溶液；與病毒陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)比，加入中和劑及中和產(chǎn)物后，對(duì)病毒的滴度影響較小(見(jiàn)表1)。

表1 中和劑及中和產(chǎn)物對(duì)病毒滴度(TCID50)的影響 lg

2.2 糞便環(huán)境對(duì)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物殺滅H5N6亞型AIV的影響

在無(wú)糞便環(huán)境下(對(duì)照組)，0.2%過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物溶液作用10 min可以將H5N6亞型AIV完全殺滅(滅活對(duì)數(shù)值為5.17±0.17)；在糞便環(huán)境下，該消毒劑需提高2.5倍用量，0.5%作用10 min才能將病毒完全殺滅(滅活對(duì)數(shù)值為5.42±0.09)(見(jiàn)表2)。

表2 在不同環(huán)境下過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物溶液對(duì)H5N6亞型AIV的滅活效果 lg

2.3 糞便環(huán)境對(duì)二氯異氰脲酸鈉殺滅H5N6亞型AIV的影響

在無(wú)糞便環(huán)境下，濃度為0.4 g/L二氯異氰脲酸鈉溶液作用10 min可以將H5N6亞型AIV完全殺滅(滅活對(duì)數(shù)值為5.50±0.00)；在糞便環(huán)境下，該消毒劑需提高2倍用量，0.8 g/L濃度作用10 min才能將病毒完全殺滅(滅活對(duì)數(shù)值為5.25±0.25)(見(jiàn)表3)。

表3 在不同環(huán)境下二氯異氰脲酸鈉溶液對(duì)H5N6亞型AIV的滅活效果 lg

2.4 糞便環(huán)境對(duì)戊二醛癸甲溴銨殺滅H5N6亞型AIV的影響

在無(wú)糞便環(huán)境下，0.25%戊二醛癸甲溴銨溶液作用10 min可以將H5N6亞型AIV完全殺滅(滅活對(duì)數(shù)值為4.75±0.25)；在糞便環(huán)境下，該消毒劑需提高4倍用量，1%作用延長(zhǎng)至30 min才能將病毒完全殺滅(滅活對(duì)數(shù)值為4.67±0.00)(見(jiàn)表4)。

表4 在不同環(huán)境下戊二醛癸甲溴銨溶液對(duì)H5N6亞型AIV的滅活效果 lg

2.5 糞便環(huán)境對(duì)癸甲溴銨殺滅H5N6亞型AIV的影響

在無(wú)糞便環(huán)境下，0.015%癸甲溴銨溶液作用10 min可以將H5N6亞型AIV完全殺滅(滅活對(duì)數(shù)值為5.17±0.25)；在糞便環(huán)境下，該消毒劑需提高8倍用量，0.12%作用延長(zhǎng)至30 min才能將病毒完全殺滅(滅活對(duì)數(shù)值為5.13±0.24)(見(jiàn)表5)。

表5 在不同環(huán)境下癸甲溴銨溶液對(duì)H5N6亞型AIV的滅活效果 lg

2.6 糞便環(huán)境對(duì)戊二醛苯扎溴銨殺滅H5N6亞型AIV的影響

在無(wú)糞便環(huán)境下，0.1%戊二醛苯扎溴銨溶液作用10 min可以將H5N6亞型AIV完全殺滅(滅活對(duì)數(shù)值為5.09±0.42)；在糞便環(huán)境下，該消毒劑需提高4倍用量，0.4%濃度作用10 min才能將病毒完全殺滅(滅活對(duì)數(shù)值為5.25±0.25)(見(jiàn)表6)。

表6 在不同環(huán)境下戊二醛苯扎溴銨溶液對(duì)H5N6亞型AIV的滅活效果 lg

3 討論

本研究選擇了5種養(yǎng)殖場(chǎng)常用的消毒劑，評(píng)估在糞便環(huán)境下對(duì)各種消毒劑殺滅目前流行的H5N6亞型HPAIV的影響。結(jié)果表明，這5種消毒劑均受到家禽糞便環(huán)境的影響。與無(wú)糞便環(huán)境對(duì)比，殺滅糞便中H5N6亞型HPAIV，過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物溶液作用濃度需提高2.5倍，二氯異氰脲酸鈉溶液作用濃度需提高2倍，戊二醛癸甲溴銨溶液作用濃度需提高4倍，癸甲溴銨溶液作用濃度需提高8倍，戊二醛苯扎溴銨溶液作用濃度需提高4倍。相較而言，過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物溶液、二氯異氰脲酸鈉溶液受糞便的影響較小；戊二醛癸甲溴銨溶液與戊二醛苯扎溴銨溶液受糞便的影響較大，癸甲溴銨溶液受糞便的影響最大。與各消毒劑最大推薦濃度相比，過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物溶液、二氯異氰脲酸鈉溶液、戊二醛苯扎溴銨溶液在糞便環(huán)境下均可以有效滅活H5N6亞型HPAIV，而癸甲溴銨溶液、戊二醛癸甲溴銨溶液在糞便環(huán)境下均不能有效滅活H5N6亞型HPAIV，使用時(shí)需提高至最大推薦濃度以上。銀濤等[10]在對(duì)戊二酸消毒劑滅菌效果研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)添加有機(jī)物來(lái)影響消毒劑消毒效果，隨著消毒劑濃度的降低，有機(jī)物影響效果越明顯。糞便可以吸附并且中和消毒劑，阻礙了與病毒的直接接觸，從而顯著降低了消毒劑的活性，影響消毒效果。因此對(duì)于糞便殘留物的消毒，應(yīng)選用穿透力和氧化性強(qiáng)的消毒劑，例如二氯異氰脲酸鈉溶液等。