黃杰，代幸如，殷邵杰，黃俊杰，劉明江，伯若楠，李金貴

(揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚州 225009)

柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)是一種細胞內(nèi)頂復(fù)門寄生蟲[1]，臨床感染可引起雞的球蟲病，易造成死亡率高、耐過雞生長遲緩或繼發(fā)其他感染，對現(xiàn)代養(yǎng)雞業(yè)危害十分嚴重[2]。該球蟲寄生于雞盲腸腸道上皮細胞內(nèi)，可引起雞腹瀉、血便、生長遲緩、飼料轉(zhuǎn)化率降低，雛雞感染可致大量死亡。目前，抗球蟲藥的使用是預(yù)防和治療球蟲病的常用手段之一。然而，大規(guī)模和長期使用導(dǎo)致雞肉等產(chǎn)品中殘留藥物并引起球蟲產(chǎn)生耐藥性，進而影響公共健康和食品安全[3]。為更好地利用藥物，及時了解和評價抗球蟲藥對當(dāng)?shù)厍蛳x的治療效果以便指導(dǎo)生產(chǎn)，對雞球蟲病及球蟲抗藥性的調(diào)查、診斷、研究和分析是保護養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的必要前提。本試驗對不同地區(qū)臨床分離的13株柔嫩艾美耳球蟲進行了地克珠利(DIC)以及鹽霉素(SAL)的藥物敏感性檢測，以期為這些地區(qū)防治雞球蟲病的用藥策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗蟲珠

柔嫩艾美耳球蟲敏感株或標(biāo)準(zhǔn)株(SE)，由中國農(nóng)科院上海獸醫(yī)研究所贈送；來自江蘇、山東、福建、安徽、河南分離株共13株，具體情況見表1。

表1 各分離株分離情況

1.2 試驗動物

1日齡黃羽肉雞購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，試驗雞飼養(yǎng)于經(jīng)甲醛熏蒸消毒無球蟲雞舍中，飼喂飼料中不添加抗球蟲藥，飲水使用高壓滅菌水。

1.3 主要儀器及試劑

渦旋機WH-1；高速離心機(AnKe公司)；麥克馬斯特計數(shù)板(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所)；光學(xué)顯微鏡 (上海萊卡顯微鏡有限公司)。

胰蛋白酶，購自北京索萊寶科技有限公司；地克珠利溶液，購自天津市保靈動物保健品有限公司，批號20181003；12.96% 鹽霉素鈉預(yù)混劑，購自內(nèi)蒙古拜克生物有限公司，批號201705018。

1.4 耐藥性檢測試驗

試驗雞飼養(yǎng)至12日齡后稱重，并使用SPSS進行隨機分組，體重記為試驗前體重。每個蟲株設(shè)DIC給藥組、SAL給藥組、感染不給藥對照組和不感染不給藥對照組，每組10只。除不感染不給藥組外，其他各組于14日齡分別接種各球蟲分離株孢子化卵囊105個。DIC給藥組1 mg/kg飲水給藥，SAL給藥組60 mg/kg拌料給藥，各給藥組均于13日齡時給藥。于接種后168 h將所有雞稱重后撲殺，體重記為試驗?zāi)w重。

1.5 盲腸病變計分及卵囊計數(shù)

感染后168 h將試驗雞剖殺，采取盲腸組織觀察其病變情況并記分，按Johnson等1970年的盲腸病變記分標(biāo)準(zhǔn)進行評定，組內(nèi)平均病變記分乘以10為該組病變值。收集各組盲腸組織，剪碎至1 mm3左右，加入1%胰酶置于37 ℃消化2 h，對各組盲腸勻漿中卵囊個數(shù)進行計數(shù)，得到相應(yīng)卵囊值[4]。

1.6 耐藥性判定方法及標(biāo)準(zhǔn)

按照黃兵等[5]介紹的方法，以病變計分減少率(reduction of lesion scores, RLS)、相對卵囊產(chǎn)量(relative oocysts production, ROP)、最適抗球蟲活性百分率(percent of optimum anti-coccidial activity, POAA) 、抗球蟲指數(shù)(anti-coccidial index, ACI)等 4項指標(biāo)綜合判定不同蟲株對藥物的耐藥程度。計算公式如下：

ACI= (相對增重率+存活率)-(病變值+卵囊值)，ACI ≥160 判為陰性，ACI <160判為陽性，其中：增重=試驗?zāi)w重-試驗前體重，相對增重率=感染(不)給藥組增重/不感染不給藥組增重×100%。

RLS=(感染不用藥組平均病變計分-感染用藥組平均病變計分)/感染不用藥組平均病變計分×100%，RLS≥50% 判為陰性，RLS<50% 判為陽性。

ROP=感染用藥組平均卵囊百萬數(shù)/感染不用藥組平均卵囊百萬數(shù)×100%，其中ROP≥15% 判為陽性，ROP<15% 判為陰性。

POAA= (感染用藥組GSR-感染不用藥組GSR)/(不感染不用藥組GSR -感染不用藥組GSR)×100%，其中：GSR=籠末重/籠初重，POAA >50% 判為陰性，POAA≤50% 判為陽性。

在全部4項指標(biāo)中，全部為陰性判定為無耐藥性，1項為陽性判定為輕度耐藥，2項為陽性判定為中度耐藥，3～4項為陽性判定則為完全耐藥。

2 結(jié)果

2.1 DIC給藥組的各項指標(biāo)

2.1.1 不同地區(qū)球蟲分離株的ACI比較

根據(jù)表2可知，DIC對NT1、NT2、NT3、NT4、NT5、NT7以及HN球蟲株的ACI均小于160，耐藥性呈陽性，即在使用DIC治療的情況下，病雞臨床仍出現(xiàn)較為嚴重的血便癥狀，同時表現(xiàn)精神沉郁、閉眼縮頸、呆立不動等癥狀。對其余分離株的ACI均在170以上，臨床未見明顯球蟲病癥狀，剖檢可見盲腸僅有少量出血點，判為陰性。

表2 DIC對不同地區(qū)球蟲分離株的ACI

2.1.2 綜合耐藥性判定

根據(jù)表3可知，13株蟲株的綜合判定指標(biāo)中，NT1、NT2、NT3、NT4、NT5、HN株的4項指標(biāo)均為陽性，表現(xiàn)為完全耐藥；NT7株的4項指標(biāo)中有2項表現(xiàn)為陽性，判定為中等耐藥；SD3株的4項指標(biāo)中，有一項表現(xiàn)為陽性，判定為輕度耐藥；其余各株的4項指標(biāo)均表現(xiàn)為陰性，判定為無耐藥性。

表3 各地區(qū)蟲株對DIC綜合耐藥性的判定

2.2 SAL給藥組各項指標(biāo)

2.2.1 不同地區(qū)球蟲分離株的ACI比較

根據(jù)表4可知，使用SAL治療后，NT1、NT2、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、HN株的ACI均小于160，各組感染雞剖檢均可見盲腸顯著縮短，腸壁增厚，有明顯盲腸芯，判定為陽性；其余蟲株ACI均在160以上，感染雞臨床未見明顯球蟲病感染癥狀，判定為陰性。

表4 SAL對不同地區(qū)球蟲分離株的抗球蟲指數(shù)

2.2.2 綜合耐藥性判定

根據(jù)表5可知，在所收集并測試13株蟲株的指標(biāo)綜合判定中，NT1、NT2、NT4、NT5、NT6、NT7、HN株有3項指標(biāo)及以上均為陽性，表現(xiàn)為完全耐藥；NT3的4項指標(biāo)中有2項表現(xiàn)為陽性，判定為中等耐藥；其余各株的4項指標(biāo)均表現(xiàn)為陰性，判定為無耐藥性。

表5 各地區(qū)分離蟲株對SAL綜合耐藥性判定

3 討論

DIC是我國1997年批準(zhǔn)上市的抗球蟲藥物，最初投放使用時，臨床上僅需0.5～1 mg/kg的劑量即可達到非常好的防治效果。趙其平等[6]研究表明，1 mg/kg DIC對柔嫩艾美耳球蟲等5個艾美耳蟲種的ACI均達到180以上，始終在抗球蟲藥高效范圍內(nèi)，但應(yīng)用多年后陸續(xù)出現(xiàn)耐藥性的報道。在本試驗中，南通地區(qū)不同雞場有6株分離株對DIC均表現(xiàn)出強耐藥性，河南開封地區(qū)1株分離株表現(xiàn)完全耐藥，提示這些地區(qū)短時間內(nèi)不宜使用該藥物對球蟲進行防治，應(yīng)采用其他藥物。

SAL是聚醚類離子載體抗生素的一種，有著較廣的抗球蟲譜，人們曾經(jīng)一度認為離子載體類抗球蟲藥并不會使球蟲產(chǎn)生耐藥性，但是，由于離子載體類抗球蟲藥長期而又廣泛的使用，球蟲抗藥株的出現(xiàn)已很普遍[7]。本試驗中，南通分離株以及開封分離株均對SAL表現(xiàn)出較強的耐藥性，提示該地區(qū)不適合使用SAL作為球蟲防治藥物，由于離子載體類抗生素作用機制類似，容易產(chǎn)生交叉耐藥性，所以同類藥物也不建議使用，可以選用其他種類藥物進行防治。而其余地區(qū)分離株并沒有對本次檢測的2種藥物表現(xiàn)嚴重的耐藥性，仍可以選用DIC或SAL對球蟲病進行防治。

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，當(dāng)前球蟲感染情況依舊嚴峻[8]。而臨床養(yǎng)殖業(yè)對雞球蟲病的預(yù)防與治療基本依靠抗球蟲藥物的添加，但雞球蟲對幾乎所有的抗球蟲藥物都有對應(yīng)的耐藥蟲株出現(xiàn)。據(jù)黃儀娟等[9]報道，四川部分地區(qū)的球蟲分離株對多種常用抗球蟲藥，如：癸氧喹酯、莫能菌素、復(fù)方磺胺氯達嗪鈉等有著不同程度的耐藥性。劉瑞良[10]對湖南醴陵分離株進行藥物敏感性試驗，結(jié)果顯示，鹽霉素、莫能菌素、二硝托胺等藥物對其無治療效果，表明分離株對多種藥物產(chǎn)生了耐藥性。大量文獻表明，雞球蟲耐藥性問題在我國普遍存在[11-14]。本試驗采集了來自不同地區(qū)共13株柔嫩艾美耳球蟲，各分離株均有使用過如磺胺氯吡氫鈉等磺胺類藥物進行治療的用藥史，但臨床仍有發(fā)病表現(xiàn)，提示分離株可能對磺胺類藥物均有一定程度的耐藥性；而且南通分離株以及開封分離株均表現(xiàn)出對DIC以及SAL的耐藥性，說明部分臨床分離株有多重耐藥性，這可能與臨床長期使用同種藥物進行防治有關(guān)。故臨床使用抗球蟲藥物時，應(yīng)注意藥物的交替使用以及聯(lián)合使用，保證治療效果同時有利于避免耐藥性的產(chǎn)生。崔怡等[15]研究表明，包膜丁酸鈉與癸氧喹酯聯(lián)用可以有效預(yù)防球蟲病，并對腸道有一定保護作用。另外，中藥由于其副作用相對較小，成分復(fù)雜不容易產(chǎn)生耐藥性，所以臨床利用中草藥對球蟲病進行防治也有著良好的前景。