時(shí)菲菲，陳毓，周晨，于生蘭

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物藥學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

黨參(CodonopsispilosulaNannf.)為桔?？浦参?，主產(chǎn)于山西、陜西、甘肅等地，以根入藥，是我國藥食兩用傳統(tǒng)中藥材，可用于脾肺氣虛、內(nèi)熱消渴、氣短心悸等癥[1]。黨參的活性成分主要有：多糖、皂苷、生物堿類、甾醇類等[2]，其中以多糖含量最高，包括戊糖、己糖及糖醇、糖酸等，黨參多糖不僅具有抗氧化和抗衰老作用，經(jīng)研究還具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和血液系統(tǒng)的作用[3-5]，對(duì)黨參多糖的研究已成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。常見的多糖提取方法主要有熱水浸提法、超聲波輔助提取法[6-7]、微波輔助提取法[8-9]、酶輔助提取法[10-11]及亞臨界提取法[12]等，以上幾種提取方法各有優(yōu)劣。超聲波提取法、微波提取法和亞臨界提取法均需要使用特殊的設(shè)備且物料受熱不均勻，易影響多糖生物活性[13]；酶輔助提取法中的酶活性易受提取條件影響，提取工藝條件較復(fù)雜[14]；熱水浸提法具有提取工藝簡單、成本低、提取條件易控制、不易破壞多糖結(jié)構(gòu)、無需特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。基于熱水浸提法的上述優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)由于鮮見響應(yīng)面法優(yōu)化熱水浸提法提取黨參多糖的研究報(bào)道，本文利用響應(yīng)面法中的Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)黨參多糖熱水浸提提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)研究其體外抗氧化活性，為黨參多糖的有效提取提供理論依據(jù)，同時(shí)促進(jìn)黨參多糖的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 黨參和主要試劑

黨參，購自于甘肅省定西市漳縣；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，購自美國Sigma公司；鐵氰化鉀、苯酚、濃硫酸、乙酸鈉等均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 黨參多糖含量測定

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

無水葡萄糖于105 ℃下烘干至恒重，精密稱定10 mg于100 mL容量瓶中，蒸餾水溶解并定容，備用。精密量取上述葡萄糖溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL于20 mL容量瓶中補(bǔ)充蒸餾水至體積為4.0 mL，各容量瓶中分別加入6%的苯酚溶液2.0 mL，搖勻后加入10.0 mL濃硫酸，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液。同法以蒸餾水代替葡萄糖溶液平行配制1份空白溶液，各溶液于室溫下靜置25 min。以空白溶液作為對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液于490 nm波長處測定吸光度。

1.2.2 黨參多糖含量測定

精密稱定10 mg黨參粗多糖樣品于100 mL容量瓶中，以蒸餾水溶解并定容。精密量取黨參多糖溶液0.1 mL于25 mL的容量瓶中，蒸餾水稀釋100倍，加入6%的苯酚溶液2.0 mL，搖勻后加入10.0 mL濃硫酸，搖勻，以空白溶液作為對(duì)照，于490 nm波長處測定吸光度，根據(jù)下列公式計(jì)算黨參多糖含量。

式中，W：黨參多糖含量；c：葡萄糖質(zhì)量濃度(μg/mL)；n：溶液稀釋倍數(shù)；f：轉(zhuǎn)化系數(shù)0.9；m：黨參多糖樣品質(zhì)量(μg)。

1.3 黨參多糖提取

干燥的黨參根粉碎后蒸餾水浸泡12 h，在適當(dāng)?shù)奶崛囟?、提取時(shí)間、料液比及提取次數(shù)條件下進(jìn)行提取，于3 000 r/min離心10 min收集上清液，冷凍干燥得黨參多糖。黨參多糖得率=黨參多糖質(zhì)量(g)/黨參根粉末質(zhì)量(g)×100%。

1.4 黨參多糖提取條件單因素試驗(yàn)

在提取溫度為80 ℃、料液比為30、提取1次的條件下考察不同提取時(shí)間(1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 h)對(duì)黨參多糖得率的影響；在提取時(shí)間1.5 h、料液比為30、提取1次的條件下考察不同提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)對(duì)黨參多糖得率的影響；在提取時(shí)間1.5 h、提取溫度80 ℃、提取1次的條件下考察不同料液比(10、20、30、40、50 mL/g)對(duì)黨參多糖得率的影響；在提取時(shí)間1.5 h、提取溫度為80 ℃、料液比為30 mL/g的條件下考察不同提取次數(shù)(1、2、3、4、5)對(duì)黨參多糖得率的影響。

1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化黨參多糖提取工藝

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)之上，同時(shí)根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)和料液比(C)為試驗(yàn)自變量因素，以提取率(Y)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)方案，見表1。按照1.3項(xiàng)下提取方法，根據(jù)表1試驗(yàn)方案的提取溫度、提取時(shí)間和料液比條件下對(duì)黨參進(jìn)行提取。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案

1.6 黨參多糖體外抗氧化活性

1.6.1 清除DPPH自由基能力

參考Shimada 等[15]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。分別配制濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL的黨參多糖水溶液，與等體積的0.15 mmol/L 的DPPH無水乙醇溶液混合，搖勻后避光條件下37 ℃ 水浴30 min，以無水乙醇作對(duì)照，在517 nm波長處測定吸光度值。

1.6.2 黨參多糖清除羥基自由基能力

參照Adid等[16]的方法并適當(dāng)改進(jìn)。分別配制濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL的黨參多糖溶液2 mL于試管中，分別等體積加入6 mmol/L 的FeSO4溶液，6 mmol/L的H2O2溶液，搖勻并靜置10 min后加入6 mmol/L的水楊酸溶液2 mL，混合均勻后靜置30 min。同樣方法分別用蒸餾水代替水楊酸和黨參多糖溶液配制對(duì)照溶液和空白對(duì)照溶液。以蒸餾水為空白于510 nm波長處測定樣品溶液、對(duì)照溶液和空白對(duì)照溶液吸光度，并根據(jù)下式計(jì)算黨參多糖羥基清除率。

式中，A樣品：樣品溶液吸光度；A對(duì)照：對(duì)照溶液吸光度；A空白對(duì)照：空白對(duì)照溶液吸光度。

1.6.3 黨參多糖還原力

參照Oyaizu等[17]的方法，采用鐵氰化鉀法測定黨參多糖還原力。分別配制濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL的黨參多糖溶液，分別取各濃度黨參多糖溶液2.5 mL于10 mL離心管中，加入濃度為0.2 mol/L、pH值6.6磷酸緩沖液2.5 mL 和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，搖勻，置于50 ℃水浴條件下反應(yīng)20 min后，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，于5 000 r/min條件下離心10 min，吸取上清液5 mL于10 mL離心管中，加入0.1%FeCl32.5 mL，搖勻后靜置10 min。以蒸餾水代替FeCl3同樣條件下配制空白溶液，于700 nm波長處測定吸光度。根據(jù)下式計(jì)算黨參多糖還原力：

還原力=A0-A1，

式中，A0:樣品吸光度；A1：空白溶液吸光度。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用Design-Expert.V.8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析，利用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行線性回歸，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=683.2X-0.0725，R2=0.997，在0.2～1.2 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可用于多糖含量測定。

2.2 黨參多糖提取條件單因素試驗(yàn)

提取時(shí)間：由圖1A可見，在1.5～2.5 h時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長，黨參多糖得率增加，2.5 h后曲線趨于平緩，多糖得率無顯著增加。因此選擇1.5、2.5和3.5 h這3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

提取溫度：由圖1B可見，提取溫度60～90 ℃時(shí)，多糖得率持續(xù)增加，溫度超過90 ℃后多糖得率幾乎沒有變化。因此選擇80、90和100 ℃這3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

料液比：由圖1C可知，料液比為10～20 mL/g時(shí)，黨參多糖得率快速增加，繼續(xù)增大料液比，黨參多糖得率基本保持不變。因此選擇料液比為10、20和30 mL/g這3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

提取次數(shù)：由圖1D可知，提取次數(shù)對(duì)黨參多糖得率無明顯影響，為提高提取效率，將提取次數(shù)固定為1次。

圖1 提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)、料液比(C)和提取次數(shù)(D)對(duì)黨參多糖得率的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化黨參多糖提取工藝

2.3.1 模型的建立與檢驗(yàn)

以提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)、料液比(C)為變量，黨參多糖提取率(Y)為考察指標(biāo)，利用Design-Expert.V. 8.0.6.1軟件中Box-Behnken組合設(shè)計(jì)法進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.3.2 黨參多糖提取率響應(yīng)面回歸模型的建立及顯著性分析

利用Design-Expert.V. 8.0.6.1軟件對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，得到擬合模型公式為：Y=15.4-0.87A-0.49B+1.69C-0.2AB-0.84AC+0.83BC-2.81A2-0.84B2-2.41C2，對(duì)建立的黨參多糖提取率響應(yīng)面回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。模型的F值和P值分別為20.21和0.000 3，P<0.05達(dá)到顯著水平，方差分析模型失擬項(xiàng)P=0.201 7>0.1，表明模型失擬不顯著，建立的二次模型可用以分析和預(yù)測黨參多糖提取率，可信度較高。相關(guān)系數(shù)R2=0.962 9，擬合模型的調(diào)整R2(AdjR2)=0.915 3，兩者較接近，說明該模型預(yù)測情況與實(shí)際情況接近，擬合度良好。表3中對(duì)回歸模型系數(shù)的顯著性結(jié)果分析顯示，一次項(xiàng)A、C以及二次項(xiàng)A2、B2系數(shù)的顯著性均小于0.05，對(duì)提取率影響顯著，表明A、C是黨參多糖提取過程中的重要影響因素，A2、B2對(duì)最終結(jié)果影響顯著，而交互作用系數(shù)均大于0.05，表明交互作用關(guān)系相對(duì)較弱，對(duì)最終結(jié)果無顯著影響。3個(gè)影響因子對(duì)黨參多糖提取的影響大小順序?yàn)镃(料液比)>A(提取時(shí)間)>B(提取溫度)。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析

2.3.3 黨參多糖提取等高線圖和三維響應(yīng)面圖分析

各因素交互作用等高線及響應(yīng)面如圖2。各因素交互作用越顯著則等高線形狀越接近于橢圓形，而交互作用越不顯著則等高線形狀越接近于圓形[18]。由圖2以看出AB、AC、BC的交互作用等高線均呈橢圓形，但AC和BC交互作用形成的橢圓形趨勢更明顯，說明AC和BC交互作用更顯著，這與方差分析結(jié)果一致，AC和BC交互作用的P值分別為0.061 9和0.063 7，接近顯著水平。響應(yīng)面坡度越陡，說明條件改變對(duì)響應(yīng)值影響越大,由圖2可見，黨參多糖的提取率隨著料液比和提取時(shí)間的降低先緩慢增加，到達(dá)最高點(diǎn)后急劇下降，形成較陡的坡度，說明提取率對(duì)料液比和提取時(shí)間的改變較為敏感，這與方差分析結(jié)果相一致。

圖2 交互作用對(duì)黨參多糖提取率的影響

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面法建立的模型預(yù)測黨參多糖最佳提取工藝條件為：提取時(shí)間2.29 h、提取溫度89.14 ℃、提取料液比23.72 mL/g，在此條件下黨參多糖的提取率預(yù)測值為15.83%。為驗(yàn)證所建立模型的可靠性，根據(jù)操作的可行性對(duì)預(yù)測工藝條件稍作調(diào)整：提取時(shí)間2.3 h、提取溫度89 ℃、提取料液比24 mL/g。在調(diào)整后的工藝條件下進(jìn)行提取試驗(yàn)，平行提取3次，測得黨參多糖的提取率為(15.66±0.04)%，與模型預(yù)測值較為接近，說明優(yōu)化方法及建立的模型可靠，預(yù)測性良好。

2.4 黨參多糖抗氧化性

2.4.1 清除DPPH自由基能力

由圖3可知，VC對(duì)DPPH的清除作用強(qiáng)于黨參多糖。黨參多糖對(duì)DPPH的清除作用呈濃度依賴型，在0.25～4.0 mg/mL范圍內(nèi)隨著濃度的升高清除作用增強(qiáng)顯著，質(zhì)量濃度大于4.0 mg/mL后，清除作用增強(qiáng)緩慢，濃度在8.0 mg/mL清除率在90%以上，接近于VC對(duì)DPPH的清除作用。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行線性擬合得出回歸方程為：Y=20.539lnX+51.393，R2=0.990 8，根據(jù)回歸方程計(jì)算出黨參多糖對(duì)DPPH半清除率IC50為0.93 mg/mL。

圖3 黨參多糖對(duì)DPPH自由基清除率

2.4.2 黨參多糖清除羥基自由基能力

由圖4可知，在0.25～8.0 mg/mL范圍黨參多糖對(duì)羥基自由基清除能力隨著濃度的增大而增大，當(dāng)質(zhì)量濃度為8.0 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到86.88%，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行線性擬合得出方程為：Y=5.7324X+46.276，R2=0.969 1，根據(jù)方程計(jì)算出黨參多糖對(duì)羥基自由基的半清除率IC50為 0.65 mg/mL。

圖4 黨參多糖對(duì)羥基自由基清除率

2.4.3 黨參多糖還原力

還原力測定可以作為評(píng)價(jià)氧化還原活性的重要指標(biāo)，還原劑可以通過自身的還原能力清除自由基，將Fe3+還原為Fe2+，再進(jìn)一步與FeCl3發(fā)生反應(yīng)，生成在700 nm波長處有吸收的產(chǎn)物，還原力越強(qiáng)則吸光度越大。由圖5可知，黨參多糖還原力遠(yuǎn)弱于VC，但其還原力與自身濃度呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.97，當(dāng)濃度為8.0 mg/mL時(shí)，還原力達(dá)到0.85。

圖5 黨參多糖還原能力

3 討論

植物多糖是一類極性較強(qiáng)的大分子化合物，種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要存在于細(xì)胞壁中，且易溶解于水中，不溶解于有機(jī)溶劑，故在植物多糖的提取中多以水作為溶劑，通過加熱的方法加速多糖的釋放，但提取溫度、提取時(shí)間、料液比等因素對(duì)多糖提取率影響較大，合理的熱水浸提提取條件可以有效提高多糖的提取率。利用酸、堿、酶、超聲、微波等手段可有效破解細(xì)胞壁從而有效提取植物多糖，但這些方法同時(shí)會(huì)引起多糖的降解、分子結(jié)構(gòu)改變等。本研究利用熱水浸提法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上確定了響應(yīng)面法關(guān)鍵因子及水平，并根據(jù)Box-Behnken 原理設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)方案，通過響應(yīng)面分析法對(duì)黨參多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，在提取時(shí)間2.3 h、提取溫度89 ℃、提取料液比24 mL/g的條件下，黨參多糖的提取率為(15.66±0.04)%，與模型預(yù)測值較為接近，說明優(yōu)化方法及建立的模型可靠，預(yù)測性良好。郜普源等[19]采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化貴州木霉 NJAU4742 產(chǎn)木聚糖酶，優(yōu)化后胞外蛋白產(chǎn)量提高了1.5倍，而木聚糖酶產(chǎn)量提高了1.25 倍，說明該方法對(duì)于優(yōu)化菌株產(chǎn)酶也是有效的。

不同提取方法獲得的多糖抗氧化活性存在一定差異，多種檢測方法可系統(tǒng)反映抗氧化情況，自由基的清除能力和還原力測定是體外抗氧化能力評(píng)價(jià)中廣泛采用的評(píng)價(jià)指標(biāo)。本試驗(yàn)組合了不同體外檢測方法，獲得了黨參多糖清除DPPH自由基能力、清除羥基自由基能力和還原力。黨參多糖對(duì)DPPH自由基和羥基自由基有較強(qiáng)的清除能力，對(duì)2種自由基的半清除率IC50分別為0.93 mg/mL和0.65 mg/mL。當(dāng)黨參多糖濃度達(dá)到8.0 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到90%以上和86%以上；而還原力與自身濃度呈正相關(guān)，當(dāng)濃度為8.0 mg/mL時(shí)，還原力達(dá)到0.85。綜上，黨參多糖具有良好的抗氧化活性，后續(xù)試驗(yàn)將進(jìn)一步對(duì)黨參多糖進(jìn)行純化分離，深入研究其結(jié)構(gòu)及藥用價(jià)值。