張續(xù)周 李金秋 陳雪津 王雯 李芳 馬媛春 房婉萍 朱旭君

摘要：綠葉揮發(fā)物（GLVs）作為植物揮發(fā)物中的一類化合物，由C18和C16不飽和脂肪酸經(jīng)酶催化分解形成的C6和C9醛、醇及其相應(yīng)酯類組成。其中，乙酸葉醇酯是一種主要的GLVs，以Z-3-己烯醛和Z-3-己烯醇經(jīng)酶作用合成。為了解乙酸葉醇酯在茶樹耐寒性狀中的作用，以一年生茶樹品種中茶108為材料，使用乙酸葉醇酯后短時低溫（4 ℃，1.5 h）和低溫過夜（4 ℃，16 h）處理茶苗，測定茶樹冷誘導(dǎo)基因表達(dá)和茶樹生理生化特性指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸葉醇酯在短時低溫處理時可以提高冷誘導(dǎo)基因CsICE1、CsICE2、CsCBF1-CsCBF5的表達(dá);在過夜低溫處理時提高冷誘導(dǎo)基因CsRD1、CsRD2的表達(dá);短時低溫和過夜低溫處理均能分別顯著提高茶樹過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）的酶活性，從而緩解低溫脅迫對茶樹的傷害。此外，乙酸葉醇酯還誘導(dǎo)自身合成途徑關(guān)鍵酶基因CsADH1、CsADH3和CsLOX3的表達(dá)，進(jìn)一步增強茶樹耐寒能力。

關(guān)鍵詞：茶樹;綠葉揮發(fā)物;乙酸葉醇酯;低溫脅迫;耐寒性

中圖分類號：S571.101 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）24-0127-06

收稿日期：2021-08-23

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31800588）;青島農(nóng)業(yè)大學(xué)科研啟動基金（編號：1118025）;山東省良種工程子課題（編號：2321401）;青島職業(yè)技術(shù)學(xué)院重點研發(fā)專項（編號：2020ZDYF09）;北茶技藝技能傳承創(chuàng)新平臺資助。

作者簡介：張續(xù)周（1972—），男，山東菏澤人，碩士，副教授，主要從事茶樹育種與生物技術(shù)研究。E-mail：jiaonancha@126.com。

通信作者：朱旭君，博士，副教授，研究方向為茶樹育種與栽培。E-mail：zhuxujun@njau.edu.cn。

低溫是茶樹生長發(fā)育中遭受的主要非生物脅迫之一，限制了茶樹的生長發(fā)育[1]。低溫會影響細(xì)胞膜流動性，破壞細(xì)胞骨架，影響自由基產(chǎn)生和清除系統(tǒng)的平衡以及引起酶活性的改變等[2-4]。此外，低溫還會引起茶樹中兒茶素、維生素和氨基酸等品質(zhì)成分的變化[5]。茶樹受到低溫脅迫時，會發(fā)生一系列反應(yīng)以提高自身對低溫的抵抗能力，這種現(xiàn)象稱為冷馴化[5]。冷馴化過程涉及大量的生理生化變化，其中包括冷誘導(dǎo)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)的生成和抗氧化酶系統(tǒng)的作用等途徑。

某些冷誘導(dǎo)基因在低溫脅迫中的作用已經(jīng)明確[6-8]，如ICE（inducer of CBF expression）在收到冷脅迫信號后，與CBF（C-repeat binding factor）啟動子結(jié)合誘導(dǎo)CBF基因表達(dá)[9]，CBF識別CRT/DRE順式作用元件調(diào)控下游COR（cold regulate）基因的轉(zhuǎn)錄，編碼親水性多肽增強細(xì)胞脂膜穩(wěn)定性從而提高植物抗寒性[10]。其中，COR基因是一類在低溫下可以快速表達(dá)的植物抗寒基因，也可以稱為LTI（low temperature induced）、KIN（cold induced）、RD（response to dehydration）、ERD（early dehydration induced）基因[11]。

綠葉揮發(fā)物（green leaf volatiles，簡稱GLVs）是植物揮發(fā)物中的一類化合物，包括C16和C18不飽和酶和異構(gòu)酶等作用下生成相應(yīng)的醇和酯類[12-13]。脂氧合酶（lipoxygenase，簡稱LOX）和氫過氧化物裂解酶（hydroperoxide yase，簡稱HPL）作為脂氫過氧化物裂解酶催化形成C6和C9醛，進(jìn)一步通過脂質(zhì)代謝途徑合成GLVs[12-15]。同時，GLVs含量也對合成酶具有反饋調(diào)節(jié)作用，如外源施用順-3-己烯醇能在24 h內(nèi)顯著誘導(dǎo)茶樹LOX和ADH基因的表達(dá)[16]。GLVs在植物遭受機械損傷，草食性昆蟲蟲害，病原菌感染[15]時發(fā)揮防御作用;干旱、高溫、低溫[13]、強光和重金屬等非生物脅迫[17-19]也會促進(jìn)GLVs的釋放。此外，外源施用生長素和赤霉素也會誘導(dǎo)甜瓜CmLOX09基因的表達(dá)[20]。外源Z-3-己烯醇可以通過反向調(diào)節(jié)自身合成關(guān)鍵酶基因LOXs、ADHs的表達(dá)，誘導(dǎo)DREB-2A和RDs基因表達(dá)并通過提高抗氧化酶活性等途徑提高茶樹對干旱脅迫的抗性[18]。乙酸葉醇酯是一種主要的綠葉揮發(fā)物，Z-3-己烯醛和Z-3-己烯醇（Z-3-HAC）經(jīng)乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，簡稱ADH）和?；D(zhuǎn)移酶（acyltransferase，AAT）作用最終生成乙酸葉醇酯，乙酸葉醇酯在茶樹中的作用研究還未曾見。

本研究通過外源使用乙酸葉醇酯，測定低溫處理后茶苗相關(guān)的生理特性指標(biāo)和冷誘導(dǎo)基因表達(dá)情況，初步明確了乙酸葉醇酯在茶樹抗寒性中的作用，為進(jìn)一步深入研究乙酸葉醇酯在茶樹低溫脅迫中的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料茶樹品種中茶108為一年生扦插茶苗，購于南京雅潤茶業(yè)有限公司。于2019年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)實驗室進(jìn)行試驗處理。茶苗處理前在人工氣候箱中培養(yǎng)2個星期，培養(yǎng)條件為光照 16 h（25 ℃）/黑暗8 h（20 ℃），光照度3 600 lx，相對濕度60%～70%。

1.2 試驗方法

T1（短時低溫處理）：乙酸葉醇酯（溶劑為二氯甲烷）處理1.5 h，4 ℃低溫處理1.5 h;CK1（短時低溫對照）：二氯甲烷處理1.5 h，室溫放置3 h，4 ℃低溫處理1.5 h。T2（低溫過夜處理）：乙酸葉醇酯（溶劑為二氯甲烷）處理1.5 h，室溫放置0.5 h，4 ℃低溫處理16 h;CK2（低溫過夜對照）：二氯甲烷處理1.5 h，室溫放置0.5 h，4 ℃低溫處理16 h。取第1、2葉放入液氮速凍，-80 ℃保存。

1.3 測定指標(biāo)及方法

參照酸性茚三酮顯色法測定游離脯氨酸含量;采用超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、過氧化物酶（POD）試劑盒和過氧化氫酶（CAT）試劑盒測定相應(yīng)酶活性，試劑盒均購于南京建成生物工程研究所有限公司;高效液相色譜法GB/T 8313—2008測定茶葉中兒茶素各組分含量。

葉片總RNA使用艾德萊 RN5301 EASYspin Plus 多糖多酚/復(fù)雜植物RNA快速提取試劑盒提取。RNA 反轉(zhuǎn)錄使用PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser（日本 TaKaRa 生物公司）試劑盒進(jìn)行。利用qRT-PCR反應(yīng)測定茶樹GLVs合成相關(guān)基因CsADH和CsLOX，以及抗寒相關(guān)基因CsICE、CsCBF和CsRD的相對表達(dá)量?；诓铇浠蚪M數(shù)據(jù)庫（http：//tpia.teaplant.org/index.html）獲得茶樹相關(guān)基因序列，利用Primer5設(shè)計特異性引物（表1）。qRT-PCR反應(yīng)試驗使用SYBR Green PCR master mix試劑盒（日本TaKaRa生物公司），儀器使用Bio-Rad IQ5實時熒光定量儀（Bio-Rad，USA），內(nèi)參基因為β-actin。定量反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)[21]。每個處理試驗重復(fù)3次，基因相對表達(dá)量分析采用2ΔΔCT法計算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2010和SPSS Statistic 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，方差分析多重比較采用Duncan’s新復(fù)極差法，P<0.05表示差異顯著。采用Graphpad Prism 5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下乙酸葉醇酯對茶樹GLVs合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

茶樹中GLVs主要來源于亞麻酸降解途徑，該途徑中的關(guān)鍵酶為LOX、HPL和ADH。外源Z-3-己烯醇能在24 h內(nèi)顯著誘導(dǎo)茶樹LOXs、ADHs部分基因積累，對HPL無明顯效果[18]。為了解低溫環(huán)境下外源施用乙酸葉醇酯對GLVs合成途徑關(guān)鍵酶基因的影響，測定CsADH1、CsADH2、CsADH3和CsLOX1、CsLOX2、CsLOX3的表達(dá)情況，結(jié)果（圖1）表明，短時低溫（4 ℃，1.5 h）下外源乙酸葉醇酯顯著提高了CsLOX3積累量（P<0.05），顯著抑制了CsADH1、CsADH2、CsADH3的表達(dá)。 低溫過夜處理（4 ℃，16 h）中外源乙酸葉醇酯處理使CsADH1、CsADH3和CsLOX3表達(dá)量顯著增加，CsADH2和CsLOX1表達(dá)量顯著降低。

2.2 低溫脅迫下乙酸葉醇酯對茶樹耐寒相關(guān)基因表達(dá)的影響

茶樹在低溫脅迫下，一些冷誘導(dǎo)基因表達(dá)會上調(diào)，CsICE和CsCBF是低溫信號傳遞中的重要元件，能夠感受上游信號并將低溫信號向下游傳遞[22-24]。為明確外源施用乙酸葉醇酯對低溫脅迫下冷誘導(dǎo)基因表達(dá)的影響，測定了CsICEs、CsCBFs和CsRDs部分基因的表達(dá)情況（圖2）。短時低溫處理（4 ℃，1.5 h）中外源乙酸葉醇酯顯著提高了CsICE1、CsICE2和CsCBF1～CsCBF5的表達(dá)量;CsRD1-CsRD3表達(dá)降低。 低溫過夜處理（4 ℃，16 h）中， 外源乙酸葉醇酯處理使CsICE1、CsRD1 和CsRD2積累增加，顯著降低了CsCBF1～CsCBF5和 CsRD2的表達(dá)量，對CsICE2無顯著影響。

2.3 低溫脅迫下乙酸葉醇酯對茶樹生理指標(biāo)的影響

2.3.1 茶樹保護(hù)酶活性 茶樹在受到低溫脅迫時

產(chǎn)生大量活性氧會使膜脂發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，為保護(hù)細(xì)胞免受傷害，抗氧化酶系統(tǒng)被激活。通過測定茶樹抗氧化酶系統(tǒng)中重要的氧化酶SOD、POD和CAT活性，發(fā)現(xiàn)外源乙酸葉醇酯使POD活性在短時低溫（T1）和低溫過夜處理（T2）時均增加;SOD和CAT活性在施用乙酸葉醇酯后低溫過夜處理時表達(dá)量增加，但在未施用乙酸葉醇酯的短時低溫處理中表達(dá)量更高（圖3）。

2.3.2 茶樹游離脯氨酸含量 脯氨酸是植物細(xì)胞抗寒的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，在低溫脅迫下，游離脯氨酸含量會增加，以增加細(xì)胞液濃度，增強細(xì)胞保水能力，從而增強細(xì)胞耐寒性[2]。外源乙酸葉醇酯使短時低溫（T1）和過夜低溫處理（T2）中茶樹葉片游離脯氨酸含量均降低，分別降低了16.76%和69.68%（圖4）。

2.3.3 茶樹葉片中兒茶素和咖啡堿含量 低溫脅迫會影響茶樹葉片中理化成分的合成，進(jìn)而影響茶葉的品質(zhì)，本試驗測定了茶葉中主要兒茶素單體成分和咖啡堿含量（圖5），施用外源乙酸葉醇酯，茶樹葉片中GC的含量在低溫過夜處理（T2）相對更高，茶樹葉片中ECG和CG在短時低溫處理時（T1）含量均增加。外源乙酸葉醇酯處理在茶樹短時和過夜低溫處理時，咖啡堿含量均明顯減少。

3 討論與結(jié)論

植物正常生長情況下體內(nèi)只存在極少量的綠葉揮發(fā)物，在受到機械損傷、低溫、干旱和蟲害等外界脅迫時，能迅速釋放大量綠葉揮發(fā)物來抵抗外界脅迫[25]。本試驗在低溫脅迫前使用乙酸葉醇酯進(jìn)行處理，通過研究短時低溫處理和過夜低溫處理中茶樹葉片LOXs、ADHs部分基因和冷脅迫誘導(dǎo)基因ICEs、CBFs和CORs家族部分成員的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)乙酸葉醇酯能在短時低溫處理時顯著誘導(dǎo)CsLOX3的表達(dá);過夜低溫處理時CsADH1和CsADH3的相對表達(dá)量也增加。GLVs可以通過反向調(diào)節(jié)自身合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，促進(jìn)綠葉揮發(fā)物和茉莉酸等激素的合成，進(jìn)一步增強茶樹抗性[16]。乙酸葉醇酯使短時低溫處理時CsICE1、CsICE2、CsCBF1、CsCBF5基因的表達(dá)被誘導(dǎo);低溫過夜處理時，CsRD1和CsRD2基因的表達(dá)量增加，而CsCBF1～CsCBF5基因的表達(dá)量降低。這可能與CBF基因和RD基因響應(yīng)冷脅迫順序有關(guān)，CBF在低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中位于上游環(huán)節(jié)，響應(yīng)冷脅迫迅速;RD基因在下游環(huán)節(jié)，響應(yīng)冷脅迫時間較長[26-27]。CBF基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在低溫脅迫下15 min后迅速積累，2 h含量達(dá)到最高水平后逐漸下降，而COR（RD）基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物才開始積累[10]。

SOD、POD和CAT是細(xì)胞抗氧化酶的重要組成部分，能夠在植物受到非生物脅迫時清除細(xì)胞內(nèi)的自由氧，維持植物體內(nèi)的活性氧代謝平衡，緩解自由氧對細(xì)胞的傷害[28]。本試驗中外源乙酸葉醇酯的施用顯著提高了低溫過夜處理下茶樹葉片SOD、POD和CAT的酶活性。此外，外源乙酸葉醇酯的施用還會影響茶樹葉片的理化成分，增加了低溫脅迫下茶樹體內(nèi)GC、ECG和CG的含量，降低了咖啡堿含量。

本試驗結(jié)果表明，乙酸葉醇酯在短時低溫（4 ℃，1.5 h）和低溫過夜處理（4 ℃，16 h）中可通過提高自身合成基因CsADH1、CsADH3和CsLOX3的表達(dá)量;促進(jìn)冷誘導(dǎo)基因CsICE1、CsICE2、CsCBF1～CsCBF5、CsRD1和CsRD2按冷信號傳導(dǎo)順序表達(dá);增強SOD、POD和CAT酶活性等方式提高茶樹的抗寒性。

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