龐俊秀 薛惠芬 劉婉秋 龍鴻

摘 要：? 三倍體丹參是以二倍體丹參為父本、人工染色體加倍的四倍體白花丹參為母本雜交選育的雜交種。為深入了解三倍體丹參花粉的特性，以及為三倍體種質利用提供孢粉學依據(jù)，該文以二倍體丹參為對照，研究了三倍體丹參雜交種花粉的形態(tài)變異規(guī)律。利用光學顯微鏡和掃描電鏡對二倍體和三倍體丹參的花粉萌發(fā)溝、外壁紋飾、花粉粒形狀等特征進行了顯微和超微形態(tài)觀察，綜合進行了花粉形態(tài)差異比較，并對花粉大小和形狀數(shù)據(jù)進行了差異顯著性分析和正態(tài)檢驗。結果表明：（1）二倍體丹參為6溝花粉，三倍體花粉萌發(fā)溝有6溝和8溝兩種類型，溝內疣狀顆粒分布不勻，出現(xiàn)畸形萌發(fā)溝。（2）二倍體和三倍體花粉外壁均為網狀雕紋。二倍體花粉網眼內具多個多邊形穿孔，穿孔大;6溝和8溝兩種類型的三倍體花粉網眼無穿孔或僅有幾個小穿孔，6溝和8溝花粉的外壁雕紋相同。（3）三倍體花粉的極軸長（P）和赤道寬（E）均值顯著小于二倍體花粉，花粉大小呈偏正態(tài)分布，P*E的差異系數(shù)大于二倍體花粉，且有極值存在。三倍體和二倍體丹參的萌發(fā)溝和雕紋存在差異，而花粉形狀差異不顯著。綜上結果表明三倍體丹參花粉在倍性效應和雜合性的雙重影響下發(fā)生了形態(tài)變異，且有多種形態(tài)變化。

關鍵詞： 丹參， 白花丹參（變型）， 二倍體， 三倍體， 花粉形態(tài)

中圖分類號：? Q938; S567.5+3

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2021）12-1996-08

收稿日期：? 2020-07-27

基金項目：? 國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201810061004） [Supported by the National Innovation and Entrepreneurship Training Program for College Students （201810061004）]。

作者簡介： 龐俊秀（1999-），主要從事植物資源鑒定評價研究，（E-mail）2690390206@qq.com。

通信作者：? 龍鴻，博士，教授，主要從事果樹遺傳、發(fā)育生物學研究，（E-mail）longhong@tjau.edu.cn。

Pollen morphology of triploid Salvia miltiorrhiza hybrid

PANG Junxiu， XUE Huifen， LIU Wanqiu， LONG Hong*

（ College of Horticulture and Landscape， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384 ）

Abstract：? To study pollen characteristics of triploid Salvia miltiorrhiza （tetraploid S. miltiorrhiza f. alba × diploid S. miltiorrhiza） hybrid， morphological variation of triploid pollen during the triploid process was examined. Triploid and diploid pollen were observed at microscopic and ultra-microscopic level using light and scanning electron microscopes. Pollen size and shape data were analyzed to determine statistical significance. The results were as follows： （1） Compared to typical 6-colpate diploid pollen grains， triploid S. miltiorrhiza are 6- or 8-colpate， with increased number of colpi and heterogenous granules on colpus membranes， and abnormal colpate. （2） Exine sculpturing of triploid pollen was reticulate like the diploid. Both 6- and 8-colpate triploid pollen had no perforation or a few small perforations， whereas diploid pollen had many large polygonal perforations in each lumen. （3） In terms of size， mean of the polar axis （P） and equatorial axis （E） in triploid pollen were significantly smaller than that of diploid pollen. The pollen size of triploid hybrid followed a skewed normal distribution， and? the coefficient of variation （CV） in P*E value of triploid was greater than that of diploid and existed extreme values. Comparison data revealed variance in colpi and sculpture between triploid and diploid， however no significant differences in pollen shape is found. Overall， the triploid S. miltiorrhiza pollen has more morphological variations due to genetic effect of both ploidy level and heterozygosity.

Key words： Salvia miltiorrhiza， S. miltiorrhiza f. alba， diploid， triploid， pollen morphology

丹參（Salvia miltiorrhiza）是唇形科（Labiatae）鼠尾草屬（Salvia Linn.）多年生草本植物，其干燥根和根莖為傳統(tǒng)中藥，具有活血祛瘀、通經止痛、清新除煩等功效（國家藥典委員會，2015）。丹參為大宗藥材，自20世紀70年代中期野生丹參已不能滿足需求，市售丹參以栽培品為主，栽培種源多來自當?shù)匾吧尤海唇涍^人工選擇。丹參種植主要采用種子繁殖和根段繁殖，長期以來，品種只種不選，從而導致品種混雜、種性退化、藥材產量和質量下降（高山林等，1995）。

種間雜交（hybridization）和多倍體化（polyploidization）是引入遺傳變異的重要手段，多倍體品種通常在生長活力、抗逆性等方面優(yōu)于二倍體品種，藥用植物多倍化顯著增加次級代謝產物的含量（Salma et al.， 2017）。野生丹參植株為二倍體，多倍體育種始于1987年，四倍體植株在田間性狀、產量、藥材外觀、化學成分含量、藥理活性等方面均優(yōu)于二倍體（高山林等，1995）。有研究以紫色花為標記性狀，將白花丹參（變型）（S. miltiorrhiza f. alba）染色體加倍，以四倍體白花丹參植株為母本，與來自不同地區(qū)的二倍體紫花丹參雜交，選育出性狀優(yōu)良的丹參三倍體雜交種（陳力和李秀蘭，2008;李秀蘭和陳力，2012）。白花丹參（變型）于2018年由李曉娟等鑒定為中華白花丹參（S. sinealba）（李曉娟等，2018）。三倍體丹參在植株形態(tài)上保留了多倍化優(yōu)勢，與二倍體紫花丹參相比葉更寬，葉色更深，長勢更好，根條數(shù)、根部鮮質量增加;在主要藥物成分上，三倍體丹參表現(xiàn)出雜交種優(yōu)勢，隱丹參酮和丹參酮ⅡA含量均高于二倍體和四倍體親本，丹酚酸B和丹參酮Ⅰ含量介于親本之間（李秀蘭和陳力，2012）。三倍體丹參經組培擴繁后已應用于大田生產。

生產實踐中，三倍體還可作為載體將攜帶的親本基因型轉移到其他物種中（Ehlenfeldt & Hanneman， 1984）。以三倍體郁金香作為花粉供體的雜交組合顯示，三倍體親本產生了非整倍體和整倍體（x，2x，3x）配子，并且回交后代（BC1）中存在大量基因組重組（Marasek-Ciolakowska et al.， 2014）。楊樹（Populus spp.）育種中，三倍體也多次作為橋梁親本，育成了三倍體、四倍體和非整倍體后代（李代麗等，2019）。

花粉形態(tài)由基因控制，受外界環(huán)境影響較小，具較強的遺傳保守性，是開展三倍體種質利用的基礎數(shù)據(jù)。以花粉大小、形狀、穿孔直徑和網脊寬度等參數(shù)對不同倍性的芍藥花粉形態(tài)聚類分析發(fā)現(xiàn)，有共同親本Paeonia lactiflora的四倍體品種和二倍體品種聚為一組，而同樣以P. lactiflora為共同親本的三倍體品種，因有另一個共同親本P. officinalis而聚在另外一組，表明花粉形態(tài)可用于雜交種親緣關系的鑒定并為雜交育種提供指導（Hao et al.， 2016）。鼠尾草屬植物通常為6溝花粉（Henderson et al.， 1968）。Maurizio（1956）報道草原鼠尾草（Salvia pratensis）和一串紅（S. splendens）的2n品系花粉均為6溝，3n、4n品系花粉中則產生6～12溝多種萌發(fā)溝數(shù)量的花粉（Henderson et al.， 1968; 埃爾特曼，1978），說明鼠尾草屬的多倍體品系花粉隨倍性增加萌發(fā)溝數(shù)量增加，且萌發(fā)溝數(shù)量出現(xiàn)分化?；ǚ鄞笮∨c核內 DNA 含量呈正相關，在四倍體、六倍體等多倍體的種類中，花粉比雙倍體大（埃爾特曼，1978）。青黑楊雜種三倍體飽滿花粉直徑的變化區(qū)間遠大于相同雜交組合二倍體雄株的花粉變化，推測是由于三倍體復雜的染色體分離行為，使得花粉中含有不同的染色體數(shù)目，從而使三倍體產生大小不一的花粉（李代麗等，2019）。這些研究都表明，三倍體花粉的形態(tài)既受親本影響，又因雜交和倍性的影響而產生變化。

三倍體丹參兼具多倍體和雜交種雙重優(yōu)勢，可作為丹參遠緣雜交和多倍體育種的親本試材（張鈮璇等，2019）。二倍體丹參花粉形態(tài)已有報道（徐任生，1990;楊德奎等，2003），李曉娟（2013）研究了丹參和白花丹參（變型）花粉的形態(tài)差異，三倍體丹參是以二倍體丹參為父本、以四倍體白花丹參（變型）為母本的雜交種，但其花粉形態(tài)尚無孢粉學特征分析。本文以二倍體丹參為對照，研究三倍體丹參雜交種花粉的外壁紋飾、萌發(fā)溝、花粉粒形狀等花粉的形態(tài)特征，為三倍體丹參種質的利用、丹參雜交育種提供孢粉學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

丹參為市場銷售的普通丹參種苗，產地為河南伏牛山。四倍體白花丹參×二倍體丹參雜交選育的三倍體材料由南開大學生命科學學院陳力教授惠贈，為三倍體組培苗，經煉苗后移栽至天津農學院實驗室。室溫條件下盆栽種植，營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1，高溫滅菌冷卻后埋根，每個長形塑料盆中放2～3個根莖，株距10～15 cm。于丹參盛花期（2019年4月）選擇丹參二倍體、三倍體花序相同部位、剛展開的新鮮花朵，用鑷子剝取花藥，分別置于干凈的1.5 mL的離心管內保存。一部分花藥用于光學顯微鏡（light microscope， LM）觀察，另一部分花藥用于掃描電鏡（scanning electron microscope， SEM）觀察。

1.2 方法

1.2.1 花粉形態(tài)觀察 光學顯微鏡觀察： 將花粉抖落在載玻片上，滴蒸餾水，蓋上蓋玻片。用LEICA DM4000B正置顯微鏡在（1 000×）的視野下選擇分散、獨立的花粉粒，先用LAICA DFC 450數(shù)字相機拍照，再用LEICA LAS軟件計數(shù)及測量花粉的長和寬。

掃描電鏡觀察： 參照顧欣等（2013）、張永芳等（2016）處理花粉的方法，先用簽字筆做好標記，用pH=7.0的磷酸緩沖液漂洗，然后用3%戊二醛固定，置于4 ℃冰箱過夜，固定后用pH=7.0的磷酸緩沖液漂洗3次（每次間隔15 min），再進行乙醇梯度脫水（30%、50%、70%、80%、90%各漂洗15 min，無水乙醇漂洗3次，每次間隔10 min），脫水完畢后進行干燥，最后粘樣品臺，記錄好臺號對應的花粉倍性，上機測試。在FEI Quanta 200掃描電鏡下觀察花粉粒赤道面和極面，加速電壓15 kV，挑選飽滿、具有代表性、完整的花粉粒觀察萌發(fā)孔類型和外壁紋飾以及進行拍照，使用Adobe Photoshop CS6軟件制作圖版。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 對照掃描電鏡下花粉形態(tài)，將光學顯微鏡下拍攝的花粉照片分類，用花粉赤道面觀的長和寬測量值作為花粉粒極軸（P）長度和赤道軸（E）寬度，按孢粉學研究方法計算P*E、P/E值，其中P*E代表花粉大小，P/E代表花粉形狀類型?；ǚ蹣O軸長度10～20 μm屬于小花粉，25～50 μm屬于中等大小花粉，50～100 μm屬于大花粉（王開發(fā)和王憲曾，1983）。利用SPSS軟件（IBM SPSS Statistics 25版本）分析花粉測量數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 丹參二倍體、三倍體花粉形態(tài)對比

2.1.1萌發(fā)溝 丹參二倍體、三倍體花粉外觀相近，均為黃色、單粒花粉（圖版Ⅰ）。二倍體花粉光學顯微鏡（圖版I：A）和掃描電鏡下（圖版I：D）赤道面觀都可觀察到3條等距離萌發(fā)溝，溝長近兩極，溝深，不形成合溝?；ǚ蹅让嬗^呈扁球形，溝形態(tài)與赤道面觀相同（圖版I：E）。極面觀可見6條萌發(fā)溝（圖版I：B，C，F(xiàn)，G）：在光鏡下，二倍體花粉極面隨拍攝景深不同，6條萌發(fā)溝呈米字形排列（圖版I：B），或在花粉邊緣呈6個凹槽（圖版I：C）; 電鏡下二倍體花粉極面觀呈扁長的串珠形，萌發(fā)溝凹陷（圖版I：F），或呈橢圓形，萌發(fā)溝不凹陷（圖版I：G）。二倍體花粉萌發(fā)溝數(shù)量和形狀與前人（徐任生，1990;楊德奎等，2003;李曉娟，2013）報道一致。

三倍體花粉在光學顯微鏡和掃描電鏡均觀察到赤道面觀萌發(fā)溝數(shù)量有變異，呈6條（圖版Ⅱ：J，M，N，P）或8條（圖版Ⅱ：K，L，O）萌發(fā)溝兩種類型。與二倍體花粉萌發(fā)溝相比，同一個花粉上的萌發(fā)溝寬度和深度更不規(guī)則，或出現(xiàn)畸形萌發(fā)溝（圖版Ⅱ：N）。二倍體和三倍體花粉粒的萌發(fā)溝內均勻密布疣狀顆粒，二倍體萌發(fā)溝內的顆粒物分布密度較均勻（圖版I：G1，H1，H2），三倍體萌發(fā)溝內的顆粒成簇分布，簇內顆粒緊密排列，簇間空隙較二倍體的寬（圖版Ⅱ：P1，Q1，Q2）。三倍體萌發(fā)溝數(shù)量有隨倍性增加而增加的多倍化特征;三倍體萌發(fā)溝畸形和溝內顆粒分布變化表明三倍體花粉壁形成過程中某些代謝活動異常。

2.1.2 外壁紋飾 丹參二倍體、三倍體花粉外壁均為網狀雕紋，網脊粗、平滑，網脊呈多角形。掃描電鏡下二倍體花粉赤道面和側面外壁雕紋網眼內具多個大小不一的多邊形穿孔，穿孔之間的次生網脊薄，穿孔布滿網眼，看上去較“透亮”（圖版I：D1）。三倍體花粉的赤道面外壁多數(shù)網眼內無穿孔，或穿孔數(shù)少，孔小。3條萌發(fā)溝和4條萌發(fā)溝的三倍體花粉赤道面外壁特征相同（圖版Ⅱ：M1，N1，O1）。二倍體和三倍體花粉的極面觀外壁紋飾相近，在極頂處網眼變小，穿孔也變?。▓D版I：I;圖版Ⅱ：R）。

二倍體花粉雕紋與前人（徐任生，1990;楊德奎等，2003;李曉娟，2013）報道一致，三倍體花粉雕紋與李曉娟（2013）報道的白花丹參（變型）接近。徐任生（1990）描述丹參的花粉外壁在光學顯微鏡下有不均勻細網狀紋飾，本試驗中，二倍體和三倍體花粉在光學顯微鏡下均可分辨出外壁的網狀紋飾，二倍體花粉比三倍體花粉外壁網狀紋飾更清晰，推測與兩者外壁穿孔數(shù)量不同、反光程度不同有關。

2.2 花粉大小和形狀

2.2.1 花粉大小 二倍體和三倍體花粉分別測量和拍攝了70和75?；ǚ邸Ｅc掃描電鏡照片相比，二倍體赤道面觀花粉27粒，三倍體赤道面觀花粉50粒。丹參二倍體花粉極軸（P）長為31.57～67.86 μm，均值為52.03 μm;三倍體花粉極軸長為24.00～65.28 μm，均值為43.07 μm。二倍體花粉赤道軸（E）寬為26.06～58.16 μm，均值為43.83 μm;三倍體花粉赤道軸寬為22.25～62.75 μm，均值為36.23 μm。三倍體花粉P值區(qū)間與二倍體相近、E值區(qū)間大于二倍體。但P、E以及P*E的均值均顯著小于二倍體花粉（P<0.01）（表1）。

二倍體和三倍體花粉都產生兩種大小類型的花粉， 即中等花粉和大花粉。二倍體和三倍體花粉極軸長的變異系數(shù)相同，均為20%，三倍體花粉的赤道軸寬變異系數(shù)（26%）大于二倍體花粉（18%）。二倍體花粉P*E值的變異系數(shù)為35%，三倍體花粉P*E值的變異系數(shù)為49%。由三倍體花粉的P、E極值區(qū)間和P*E值的變異系數(shù)增大可知，三倍體花粉粒大小的差異幅度比二倍體花粉大。對二倍體和三倍體花粉的P、E測量數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗發(fā)現(xiàn)，雖然二倍體和三倍體花粉測量數(shù)據(jù)的變異系數(shù)相近，但三倍體花粉大小偏向左側，P和E的偏度絕對值（分別為0.875和1.557，圖1：B， E）約為二倍體花粉P、E偏度絕對值（分別為-0.469和-0.625，圖1：A，D）的2倍，峰度也大于二倍體數(shù)據(jù)。二倍體花粉P和E沒有極值，三倍體花粉P和E均有極值存在（圖1：C，F(xiàn)），表明三倍體花粉中，P和E值小于均值的花粉數(shù)量較多，但又有個別花粉粒的P、E值偏大。

2.2.2 花粉形狀 孢粉學中，花粉形狀以P/E表示，其中P/E<0.88為扁球形，0.88

2為超長球形（王開發(fā)和王憲曾，1983）。二倍體和三倍體花粉P/E值均在0.88～1.14和1.14～2范圍內，花粉形狀為近球形和長球形兩種類型，符合鼠尾草屬花粉的一般特征（Henderson et al.， 1968）。二倍體P/E的均值為1.19±0.11，三倍體的P/E均值為1.21±0.15，差異不顯著（P>0.05）。對倍性與花粉形狀兩因素做獨立性Χ2檢驗，P>0.05，表明花粉粒形狀不受倍性影響（表2）。

3 討論與結論

花粉形態(tài)在科、屬間穩(wěn)定，花粉外壁紋飾的網眼直徑、網眼密度差異明顯，是種的分類依據(jù)，也是鑒定栽培品種親緣關系的依據(jù)（史艷財?shù)龋?020）。本研究結果中，三倍體花粉在萌發(fā)溝數(shù)量、外壁雕紋、花粉大小上均與二倍體不同，且花粉萌發(fā)溝有6溝和8溝兩種類型，花粉大小的變異系數(shù)增大，表明三倍體花粉在倍性效應和雜合性的雙重影響下發(fā)生了形態(tài)變異，且有多種形態(tài)變化。鼠尾草屬植物花粉的一般特征是花粉形狀為近球形和長球形，具有對稱的6條萌發(fā)溝和多邊形網狀雕紋，不同物種的溝數(shù)相同、網狀雕紋內的穿孔數(shù)量和大小不同，萌發(fā)溝數(shù)量隨倍性增加而增加（Henderson et al.， 1968）。在本研究中，二倍體丹參材料為普通市售丹參種苗，花粉形狀、大小、萌發(fā)溝數(shù)量和外壁雕紋形狀與不同時間的不同研究者（徐任生，1990;楊德奎等，2003;李曉娟，2013）的報道一致，表明丹參的花粉形態(tài)非常穩(wěn)定。三倍體花粉形狀為近球形和長球形，有對稱的6條或8條萌發(fā)溝，多邊形網狀雕紋，符合鼠尾草屬屬內花粉的共同特征，兼具多倍體品系萌發(fā)溝數(shù)量增加的多倍化特征。萌發(fā)溝數(shù)量隨倍性增加在其他多倍體植物花粉中亦有報道（劉文革等，2003;Lazarevic' et al.， 2013;王尚德等，2015），但形成機制未知。4n品系主要產生 2n配子，從鼠尾草屬4n品系中以8溝花粉常見，少數(shù)為6～12溝（Henderson et al.， 1968）推測，三倍體丹參中的8溝花粉可能與花粉倍性增加有關。

三倍體花粉的外壁網狀雕紋網眼內沒有穿孔或只有少量的小穿孔的形態(tài)偏向于李曉娟（2013）描述的未加倍的二倍體白花丹參（變型），且雕紋形態(tài)與萌發(fā)溝數(shù)量無關。目前，四倍體白花丹參的花粉形態(tài)尚未有報道，加倍后的白花丹參四倍體基因組在花粉形態(tài)上是否也具有這種遺傳偏好性值得進一步研究，以增進對三倍體丹參花粉外壁雕紋變異規(guī)律的理解。

花粉粒大小是孢粉學研究的重要參數(shù)。本研究中三倍體丹參花粉的P、E均值顯著小于二倍體花粉，P、E的數(shù)據(jù)均呈偏正態(tài)分布，出現(xiàn)花粉極值，即三倍體產生了更多的偏小花粉和少量大花粉。青黑楊三倍體雜交種花粉均值大于同組合二倍體雜交種，花粉最小值和最大值的變化范圍大于二倍體雜交種，數(shù)據(jù)呈偏正態(tài)分布（李代麗等，2019）;樺屬（Betula）三倍體種間雜交種產生兩種大小的花粉，小花粉數(shù)量多，花粉大小分布呈現(xiàn)2個峰值（Karlsdottir et al.， 2008）;芍藥的三倍體花粉小于二倍體花粉（Hao et al.， 2016）;西瓜三倍體的花粉大小介于四倍體和二倍體之間（劉文革等，2003）。這些研究中，與二倍體相比，三倍體花粉大小結果均不一致?？紤]到三倍體復雜的減數(shù)分裂行為，三倍體花粉中含有的染色體數(shù)目變異豐富，花粉大小的統(tǒng)計數(shù)值范圍增大，數(shù)值大小的頻數(shù)呈偏正態(tài)分布，通過花粉形態(tài)鑒定不同倍性品種的親緣關系研究，應對花粉大小數(shù)據(jù)進行檢驗和較正，避免鑒定結果產生偏差。

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（責任編輯 周翠鳴）