黃 英， 付 磊， 靳澤華， 易辰陽， 王曉萍， 張安定,3

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北武漢430070 ； 2. 湖北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心， 湖北武漢430070 ； 3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用診斷制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 科技部動(dòng)物疾病防控國(guó)際聯(lián)合研究中心， 湖北武漢430070)

雞傳染性貧血病是由雞傳染性貧血病毒(Chicken infections anemia virus,CIAV)引起的一種雞的病毒性疾病，以再生障礙性貧血和淋巴組織萎縮為主要特征。該病在世界范圍內(nèi)廣泛存在，具有很高的流行率，已給養(yǎng)雞業(yè)帶來很大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。VP1蛋白是CIAV的衣殼蛋白和免疫原蛋白，有研究表明，VP1蛋白能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體，因此,在亞單位疫苗的開發(fā)和快速診斷試劑盒的研制中，VP1蛋白被作為免疫原[4-7]。由于該病毒培養(yǎng)時(shí)的增殖滴度不夠高，很難滿足開發(fā)滅活疫苗的需求，目前只有國(guó)外的弱毒疫苗可用于該病的防控。為此，本試驗(yàn)對(duì)CIAV VP1蛋白的C端進(jìn)行大腸桿菌表達(dá)，同時(shí)探討利用伴侶蛋白實(shí)現(xiàn)VP1 C 端蛋白的可溶性表達(dá)，為CIAV新型亞單位疫苗的研制和診斷試劑的研發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 截短的VP1基因(80～449aa)，由天一輝遠(yuǎn)生物科技(武漢)有限公司進(jìn)行大腸桿菌密碼子優(yōu)化后合成；pET-28a質(zhì)粒、分子伴侶質(zhì)粒、大腸桿菌BL21(DE3)和DH5α菌株，均由本實(shí)驗(yàn)室保存；臨床CIAV陽性血清和CIAV陰性血清，均經(jīng)過商品化試劑盒(IDEXX 公司)檢測(cè)證實(shí)。

1.2 主要試劑 PrimeSTAR HS Polymerase、T4 DNA 連接酶、NcoⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒，購(gòu)自美基生物科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；Ni2+親和層析柱，購(gòu)自GE Healthcare公司；HRP標(biāo)記的山羊抗雞IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、His標(biāo)簽的鼠源抗體，均購(gòu)自Southern Biotech 公司。

1.3 方法

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)VP1的全基因合成序列，用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增VP1基因的特異性引物，上游引物為5′-AAACCATGGAAGGTCTGATTCTGCCGAAA-3′(下劃線為NcoⅠ 酶切位點(diǎn)，并加上3個(gè)保護(hù)性堿基)，下游引物為5′-AAACTCGAGCGGCTGGGTACCCCAGTACATG-3′(下劃線為XhoⅠ 酶切位點(diǎn)，并加上3個(gè)保護(hù)性堿基)。

1.3.2 目的基因的PCR擴(kuò)增 以合成的VP1基因片段為模板，用PrimeSTAR HS Polymerase 擴(kuò)增VP1片段，PCR擴(kuò)增的體系為(50 μL總體積)：質(zhì)粒模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×GC Buffer 25 μL，dNTP Mix 4 μL，Enzyme 1 μL，ddH2O 17 μL。PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋?8 ℃ 10 s，59 ℃ 5 s，72 ℃ 1 min，共32個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，對(duì)正確條帶進(jìn)行膠回收。

1.3.3 目的片段和載體的雙酶切 用NcoⅠ 和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶分別對(duì)膠回收后的產(chǎn)物和載體質(zhì)粒(pET-28a)進(jìn)行雙酶切，酶切后產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，將正確條帶回收，用T4 DNA 連接酶將VP1基因克隆至原核表達(dá)載體pET-28a。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，涂布于含有Kan+的平板上篩選陽性重組質(zhì)粒，對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確后送北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序，將其命名為pET-28a-VP1。

1.3.4 重組VP1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序正確的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)中，挑取平板上的單克隆過夜復(fù)蘇。次日將菌液接種于含有Kan+的5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)菌至OD600 nm約為 0.6 時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，之后進(jìn)行超聲破碎。破碎后制樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染液染色，8～10 h后使用脫色液脫色，圖片用凝膠成像儀拍照留存，pET-28a-VP1質(zhì)粒和伴侶質(zhì)粒共誘導(dǎo)表達(dá)的試驗(yàn)操作與上述過程相似，只是在接菌時(shí)需要額外加入Cm+抗生素，并且在轉(zhuǎn)接菌液時(shí)加入伴侶分子的誘導(dǎo)物(0.5 mg/mL L-araB)。

1.3.5 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化 比較不同的 IPTG濃度(0.08 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L)和不同的誘導(dǎo)溫度(37 ℃、28 ℃、16 ℃)，對(duì)VP1蛋白可溶性表達(dá)的影響。樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.3.6 重組VP1蛋白的純化 按照最優(yōu)的誘導(dǎo)表達(dá)條件，重新誘導(dǎo)一批1 L菌液，集菌后，用PBS洗1次菌體。去掉上清后菌體用His binding Buffer重懸，壓力破碎儀破碎菌體，然后12 000 r/min離心30 min， 收集上清，使用AKTA蛋白純化儀進(jìn)行VP1蛋白的親和層析純化，操作方法按照《AKTA蛋白純化儀操作手冊(cè)》進(jìn)行。

1.3.7 重組VP1蛋白的Western Blot 對(duì)純化的蛋白進(jìn)行Western Blot鑒定，將凝膠電泳后的蛋白樣品轉(zhuǎn)至NC膜上，然后用2% BSA+4%脫脂奶粉封閉1～2 h，加入鼠源抗His標(biāo)簽的單克隆抗體(1∶2 000 稀釋)，4 ℃過夜，用TBST洗滌3次后加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1∶5 000稀釋)，室溫?fù)u床上孵育1 h，TBST洗滌3次后用ECL顯色。

1.3.8 重組VP1蛋白的免疫反應(yīng)性 用重組表達(dá)純化的VP1蛋白(2 μg/mL)包被ELISA板，封閉好后，分別加入臨床陽性雞血清和陰性雞血清，37 ℃孵育1 h，洗滌后加入HRP標(biāo)記的山羊抗雞二抗(1∶10 000稀釋)，放在37 ℃孵育30 min，洗滌后加入底物顯色液(避光)靜置15 min，加入終止液后讀取OD450 nm值。同時(shí)，用Western Blot方法來檢測(cè)純化樣品與臨床陽性雞血清和陰性雞血清的免疫反應(yīng)性。

2 結(jié)果

2.1VP1基因的擴(kuò)增和鑒定 以合成的VP1基因(80～449aa)序列為模板，擴(kuò)增出1 131 bp的條帶，與預(yù)期大小一致(如圖1所示)。將目的片段與pET-28a載體連接，雙酶切鑒定陽性的質(zhì)粒送公司測(cè)序，結(jié)果顯示，試驗(yàn)成功構(gòu)建出重組pET-28a-VP1質(zhì)粒。

圖1 PCR 擴(kuò)增VP1基因Fig.1 Amplification for VP1 gene by PCRM: DNA相對(duì)分子質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn); 1: VP1基因的擴(kuò)增M: DNA molecular weight marker; 1:Amplification for VP1 gene by PCR

2.2 重組VP1蛋白的表達(dá)驗(yàn)證 pET-28a-VP1重組質(zhì)粒單獨(dú)誘導(dǎo)表達(dá)的VP1蛋白以及加入分子伴侶質(zhì)粒后共誘導(dǎo)表達(dá)的VP1蛋白分別經(jīng)過10% SDS-PAGE膠電泳分析，在35～40 kDa均有明顯的條帶，這與預(yù)測(cè)的重組VP1大小一致(如圖2所示)。與沒有加入分子伴侶質(zhì)粒誘導(dǎo)的VP1蛋白相比，加入分子伴侶質(zhì)粒后誘導(dǎo)VP1蛋白的上清表達(dá)量明顯增多。說明試驗(yàn)成功表達(dá)重組VP1蛋白，且分子伴侶蛋白能夠明顯提高重組VP1蛋白上清的表達(dá)量。

圖2 重組VP1蛋白的表達(dá)鑒定Fig.2 Identification of recombinant VP1 protein expressionM:蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1:空載菌的上清; 2:空載菌的沉淀; 3:不加IPTG誘導(dǎo)的上清; 4:不加IPTG誘導(dǎo)的沉淀; 5:加入IPTG誘導(dǎo)的上清; 6:加入IPTG誘導(dǎo)的沉淀; 7:L-araB和IPTG共誘導(dǎo)的上清; 8:L-araB和IPTG共誘導(dǎo)的沉淀M:Protein molecular weight marker; 1:The supernatant of empty bacteria; 2:The precipitation of empty bacteria; 3: The supernatant of non-induced r-VP1; 4: The precipitation of non-induced r-VP1; 5:The supernatant of IPTG-induced r-VP1; 6:The precipitation of IPTG-induced r-VP1; 7:The supernatant with L-araB and IPTG co-induced r-VP1; 8:The precipitation with L-araB and IPTG co-induced r-VP1

2.3 重組VP1蛋白與伴侶蛋白共誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 SDS-PAGE結(jié)果顯示，在16 ℃ 條件下VP1蛋白上清的表達(dá)量?jī)?yōu)于37 ℃和28 ℃，在最佳溫度條件下，當(dāng)IPTG的濃度是0.08 mmol/L時(shí)，VP1蛋白的上清表達(dá)量最高(如圖3所示)。

圖3 重組VP1蛋白與伴侶蛋白共誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化Fig.3 Optimization of induction conditions for co-expression of recombinant VP1 protein and chaperone proteinM:蛋白質(zhì)相當(dāng)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～2:空載菌的上清和沉淀; 3～4:0.08 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的上清和沉淀; 5～6:0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的上清和沉淀; 7～8:0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的上清和沉淀M:Protein molecular weight marker; 1～2:The supernatant and the precipitation of empty bacteria; 3～4:The supernatant and the precipitation in 0.08 mmol/L IPTG; 5～6:The supernatant and the precipitation in 0.4 mmol/L IPTG; 7～8:The supernatant and the precipitation in 0.8 mmol/L IPTG

2.4 重組VP1蛋白的Ni2+純化 如圖4A所示，純化后的樣品在35～40 kDa處出現(xiàn)明顯的條帶，與預(yù)測(cè)的VP1蛋白大小一致，且蛋白純度較高。

2.5 重組VP1蛋白的Western Blot 如圖4B所示，純化的蛋白經(jīng)Western Blot鑒定，結(jié)果顯示，在35～40 kDa處檢測(cè)到條帶，與預(yù)測(cè)的VP1蛋白大小一致，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖4 重組VP1蛋白的純化和鑒定Fig.4 Purification and identification of recombinant VP1 proteinA:考馬斯亮藍(lán)染色圖; B:Western Blot; M:蛋白質(zhì)相當(dāng)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～2:純化的樣品A:Coomassie brilliant blue staining; B:Western Blot; M:Protein molecular weight marker; 1～2: Purified samples

2.6 重組VP1蛋白的免疫反應(yīng)性 應(yīng)用間接ELISA方法檢測(cè)純化的重組VP1蛋白與CIAV陽性血清和陰性血清的反應(yīng)性。結(jié)果如圖5所示，CIAV陽性血清的讀值明顯高于CIAV陰性血清的讀值(P<0.001)， 說明重組的VP1蛋白能夠與CIAV陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合，而不與CIAV陰性血清結(jié)合，但是在Western Blot 試驗(yàn)中，CIAV的陽性血清并不能很好地與變性的VP1蛋白發(fā)生反應(yīng)，也間接說明了CIAV陽性雞血清中的抗VP1蛋白的抗體主要針對(duì)的是VP1蛋白的構(gòu)象表位。

3 討論

VP1蛋白是CIAV唯一的衣殼蛋白，它在刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的過程中扮演著重要的角色，同時(shí)在CIAV抗原、抗體檢測(cè)方面也意義重大。VP1基因的N端富含精氨酸，具備很多正電荷，較難在大腸桿菌中高效表達(dá)。為了解決這個(gè)問題，有許多學(xué)者通過直接刪除N端富含精氨酸的結(jié)構(gòu)[8]，并根據(jù)大腸桿菌偏好的密碼子進(jìn)行優(yōu)化[9]，實(shí)現(xiàn)了VP1蛋白的高量表達(dá)，但是可溶性的重組蛋白量很低，難以進(jìn)一步應(yīng)用。雖然同時(shí)表達(dá)VP1和VP2蛋白可以實(shí)現(xiàn)VP1蛋白的可溶性表達(dá)[10]，但也存在可溶性VP1蛋白含量偏低的問題。有研究指出，伴侶蛋白能夠幫助蛋白質(zhì)正確折疊，從而增加蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)[11]。本研究最開始對(duì)N端截短的VP1基因進(jìn)行大腸桿菌密碼子優(yōu)化和原核表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物主要為包涵體，這與Lee M S等的研究結(jié)果一致[9]，后面嘗試?yán)梅肿影閭H提高CIAV VP1蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，結(jié)果表明，試驗(yàn)成功利用分子伴侶使重組的VP1蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)增加，且可溶性表達(dá)的VP1蛋白經(jīng)過Ni2+純化后，其純度較高，同時(shí)應(yīng)用間接ELISA的方法初步證明表達(dá)的重組VP1蛋白具有一定的反應(yīng)原性，為CIAV的診斷試劑和新型亞單位疫苗的研制提供了科學(xué)依據(jù)。

圖5 間接ELISA分析重組VP1蛋白的免疫反應(yīng)性Fig.5 Immunoreactivity of the recombinant VP1 protein by indirect ELISA***:P<0.001， 表示有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異***：P<0.001, showing a very significant statistical difference1～4: 4組CIAV感染雞的陽性血清； 5: 陰性對(duì)照血清1～4: Four groups of CIAV-infected positive chicken samples; 5: Negative serum