胡曉妍，李冠武

（汕頭大學醫(yī)學院腫瘤分子生物學開放實驗室，廣東 汕頭 515041）

衣霉素是一種含有葡萄糖胺的嘧啶核苷類抗生素，具有抗菌、抗病毒和抗腫瘤的特性，是常用的N-糖基化抑制劑和內質網(wǎng)應激誘導劑.衣霉素可以抑制N-乙酰葡糖胺1-磷酸轉移酶，阻止真核細胞內質網(wǎng)中UDP-N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine，GlcNAc）向磷酸多萜醇轉移，抑制N-寡糖的合成，影響蛋白質構象，最終導致未折疊蛋白質聚積于內質網(wǎng)，觸發(fā)內質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）[1].衣霉素也可以通過未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）信號通路，觸發(fā)內質網(wǎng)應激.衣霉素在靶向多種糖蛋白和拮抗耐藥性方面有很大優(yōu)勢，可能提高腫瘤細胞對治療的敏感性.

1 異常糖基化促進腫瘤發(fā)展

糖基化是糖與其他糖類、蛋白質或脂質生成糖苷鍵的酶促過程，是一種重要的翻譯后修飾，在蛋白質折疊、蛋白質穩(wěn)定性、亞細胞定位和糖蛋白功能等方面有重要作用.相對于正常細胞，腫瘤細胞表現(xiàn)出廣泛的糖基化改變[2].異常糖基化是細胞復雜聚糖合成受損、產(chǎn)生異常結構的過程，與癌癥的發(fā)生、進展、轉移和化學耐藥性緊密聯(lián)系[3].目前發(fā)現(xiàn)與癌癥相關的糖基化有唾液酸化作用、巖藻糖基化、O-聚糖截斷和N-糖基化和O-糖基化等[4].

糖基化是細胞促進和調節(jié)蛋白質折疊和質量控制的重要方式.新合成的未折疊蛋白質在內質網(wǎng)進行糖基化，糖蛋白上的聚糖鏈通過天冬酰胺的酰胺基，或通過絲氨酸或蘇氨酸的羥基與多肽鏈共價相連，分別為N-糖基化和O-糖基化[3].N-糖基化參與蛋白質折疊和質量控制，N-聚糖為精確指導蛋白質底物折疊和質量控制系統(tǒng)提供模板.N-糖基化合成途徑中，焦磷酸多萜醇供體上的寡糖GlcNAc等作為預裝組件前體，被轉移到粗面內質網(wǎng)上的新生多肽NXS/T（X為脯氨酸外的任意氨基酸）共有序列的天冬酰胺殘基上[5].腫瘤細胞表面N-寡糖改變，與細胞增殖、遷移和侵襲特性有關[6].

糖基化是重要的腫瘤生物標志物，應用于臨床檢測癌癥，如糖鏈抗原（casbohydrateantigen19-9，CA19-9）和癌胚抗原（carcino-embryonicantigen，CEA）糖蛋白是監(jiān)測結直腸癌進展和復發(fā)的血清生物標志物[7].細胞表面N-糖基化的表達升高已被證明與腫瘤耐藥相關，抑制其糖基化一定程度上能夠拮抗耐藥，如N-糖基化抑制提高多藥耐藥的卵巢癌對長春新堿、阿霉素和順鉑的敏感性[8]，抑制糖基化提高乳腺癌對阿霉素的敏感性[9].衣霉素抑制多種腫瘤中的N-糖基化，可能逆轉現(xiàn)有抗腫瘤藥物的耐藥性，重新定位藥物的應用范圍.

2 內質網(wǎng)應激誘導影響腫瘤發(fā)展

內質網(wǎng)是真核細胞內膜系統(tǒng)的重要組成部分，蛋白質折疊和翻譯后修飾主要發(fā)生在內質網(wǎng)，并受嚴格的質量控制.細胞應激及任何影響內質網(wǎng)功能的因素都可能導致錯誤折疊蛋白聚集，發(fā)生未折疊蛋白反應，觸發(fā)內質網(wǎng)應激[10].內質網(wǎng)應激下，UPR信號轉導程序的三條通路相互平行，分別由三個內質網(wǎng)跨膜受體介導：雙鏈RNA激活蛋白激酶樣內質網(wǎng)激酶（double-stranded RNA-activated protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、內質網(wǎng)跨膜蛋白需肌醇酶1a（inositol-requiring enzyme 1，IRE1a）和轉錄激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）[11].這些分子有廣泛相似的激活機制，調節(jié)許多獨特或共有的內質網(wǎng)應激反應過程.正常狀態(tài)下，它們都與葡萄糖調節(jié)蛋白（glucose-regulated protein 78，GRP78）結合，呈單體和非活性狀態(tài)，應激狀態(tài)下GRP78分離.隨后，PERK通過自身磷酸化激活，進而磷酸化真核起始因子，增加轉錄激活因子（Activating Transcription Factor 4）翻譯，調節(jié)基因表達，減少蛋白質合成.IRE1獲得內切核糖核酸酶活性，導致X盒結合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）mRNA剪切產(chǎn)生轉錄因子XBP1s.ATF6轉移至高爾基體，裂解并釋放轉錄因子的胞質結構域[12].這些信號通路相互強化，執(zhí)行適應性程序，減少翻譯起始（IRE1和ATF6介導）和選擇性抑制特定mRNA翻譯（PERK介導），糾正蛋白質折疊錯誤，恢復內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài).適應不良的UPR不可逆轉內質網(wǎng)應激，而是激活UPR依賴的凋亡通路，如通過激活IRE1α介導的c-Jun氨基末端激酶（p-c-Jun N-terminal kinase，JNK），抑制抗凋亡的B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）活性，增強促凋亡蛋白（Bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim）的功能，誘發(fā)細胞凋亡[13].腫瘤細胞能夠逃避細胞凋亡途徑，并在應激狀態(tài)下生長.此外，內質網(wǎng)應激能觸發(fā)自噬體形成[14].

一些研究表明衣霉素上調內質網(wǎng)應激，抑制腫瘤的發(fā)生和化療耐藥.也有觀點認為，內質網(wǎng)應激傳感器PERK、IRE1和ATF6持續(xù)激活，增強腫瘤細胞的致瘤性、轉移能力、耐藥性和血管生成，且內質網(wǎng)應激可能阻止機體保護性的抗腫瘤免疫[15].多種腫瘤細胞存在強烈的內質網(wǎng)應激反應，且內質網(wǎng)應激常與化療耐藥有關.雖然基因突變、血管生成不足、氧氣和葡萄糖短缺、高復制和代謝需求可能導致活躍的UPR，但癌基因的表達也可能抑制內質網(wǎng)應激[16].腫瘤細胞也可能增強蛋白質復制能力，恢復穩(wěn)態(tài).衣霉素誘導的內質網(wǎng)應激在不同研究中結論不一致，可能與細胞自噬機制、涉及的信號通路、腫瘤細胞的種類及衣霉素的濃度有關.

3 衣霉素抗腫瘤及腫瘤耐藥

3.1 衣霉素通過抑制EGFR糖基化影響腫瘤細胞增殖

糖基化的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）表達持久，而去糖基化的EGFR穩(wěn)定性差.衣霉素可能誘導EGFR去糖基化，促使EGFR從胞膜轉移至胞質，從而抑制下游磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）、絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調節(jié)蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK）通路[1].乳腺癌細胞中，衣霉素下調EGFR受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）家族蛋白的表達[17]；頭頸部鱗狀細胞癌中，衣霉素抑制EGFR信號通路[1]，均抑制腫瘤細胞增殖.

3.2 衣霉素通過抑制PI3K/Akt、MAPK信號通路拮抗紫杉醇和曲妥珠單抗耐藥

PI3K/Akt、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路是EGFR家族二聚體激活的關鍵信號通路，衣霉素對PI3K/Akt和MAPK通路的影響也和EGFR的糖基化抑制密切相關.

紫杉醇用于治療晚期乳腺癌和卵巢癌，但易產(chǎn)生耐藥性，其機制可能包括紫杉醇誘導的蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）和MAPK信號通路上調、PI3K/Akt和MAPK等細胞保護通路的激活、細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2通路的激活、細胞凋亡通路的改變等[18].Shengshi Huang等人發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細胞中，衣霉素降低AKT、ERK1/2、JNK和p38的蛋白表達水平和磷酸化水平，可能拮抗紫杉醇引起的ERK1/2和JNK的磷酸化水平增加[19].

另一項研究表明衣霉素能夠提高乳腺癌細胞對曲妥珠單抗的敏感性[17].曲妥珠單抗用于治療人類表皮生長因子受體（human epidermal growth factor receptor，HER）2過表達的乳腺癌，其耐藥機制涉及EGFR/HER家族、PI3K/Akt通路、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）家族等多個交叉信號通路[20]，拮抗其耐藥性難度較大.衣霉素降低乳腺癌細胞中EGFR、HER2、HER3及ERK1/2、AKT的蛋白表達和磷酸化水平，可能拮抗對曲妥珠單抗的耐藥性.且相較于單一用藥，衣霉素和曲妥珠單抗聯(lián)用抑制PI3K/Akt和MAPK信號通路，顯著抑制乳腺癌細胞生長，促進細胞凋亡[17].

MAPK和AKT的激活導致甲狀腺未分化癌對放射性碘治療反應不佳.衣霉素可能通過降低ERK和AKT磷酸化水平，下調MAPK和AKT信號通路，進而恢復腫瘤細胞甲狀腺相關基因的表達和攝碘能力，增強放射性碘治療療效[21].衣霉素還降低甲狀腺癌細胞的糖代謝水平[21].

3.3 衣霉素通過抑制PTX3糖基化拮抗順鉑耐藥（Akt/NF-κB信號通路）

穿孔素-3（pentraxin3，PTX3）在多種腫瘤中表達上調，與腫瘤細胞增殖、轉移、病理分級和藥物敏感性有關.PTX3的N-糖基化調節(jié)PTX3的功能[22].順鉑可能通過增加PTX3的表達，減弱對肺癌的療效.衣霉素通過使糖基化的PTX3去糖基化，進而抑制Akt/核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor，NF-κB）信號通路，阻止 NF-κB 激活相關的腫瘤轉移，可能恢復肺癌細胞對順鉑的化學敏感性[23].兩者聯(lián)用抑制AKT激活和NF-κB磷酸化，增強順鉑對肺癌細胞的增殖和遷移的抑制作用[23].衣霉素也被發(fā)現(xiàn)可以通過Akt/NF-κB信號通路抑制乳腺癌細胞的生長和侵襲[24].

3.4 衣霉素通過抑制CD44的糖基化阻止腫瘤細胞遷移

細胞表面跨膜糖蛋白CD44通過結合透明質酸，參與干細胞特性的獲得，是腫瘤干細胞標志物.CD44分子糖基化導致構象變化，可能影響其結合透明質酸的能力.衣霉素可能降低CD44糖基化水平，進而阻止頭頸部鱗狀細胞癌腫瘤干細胞成球[1].CD44糖基化也參與上皮-間充質轉化，促使腫瘤細胞遷移.此外，衣霉素降低肝癌細胞的CD44s糖基化水平，下調CD44s-ERK1/2信號通路，同時阻斷驅動上皮間質轉化（epithelial-tomesenchymal transition，EMT）的轉化生長因子（transforming growth factor beta，TGF-β）信號通路，抑制肝癌細胞上皮-間充質轉化[25].

3.5 衣霉素通過激活STAT3促進腫瘤細胞增殖和免疫抑制

然而也有研究表明衣霉素可能有促進腫瘤發(fā)展的作用.信號轉導及轉錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）是多條腫瘤信號通路的交點，STAT3也與內質網(wǎng)應激相關，UPR通路中，IRE1和PERK激活STAT3.衣霉素誘導口腔鱗狀細胞癌細胞和正常口腔黏膜角化細胞白介素-6（interleukin 6，IL6）受體基因上調，正?？谇火つそ腔毎鸖TAT3和白血病抑制因子受體蛋白表達更高.IL6等生長因子激活STAT3，STAT3上調MAPK通路和自身STAT3通路，可能促進腫瘤細胞增殖和轉移，并產(chǎn)生免疫抑制因子，導致抗腫瘤免疫抑制[26].

3.6 衣霉素誘導內質網(wǎng)應激影響腫瘤發(fā)展和耐藥產(chǎn)生

關于衣霉素誘導的內質網(wǎng)應激是否促進腫瘤發(fā)展和耐藥產(chǎn)生存在爭議.多藥耐藥的胃癌細胞對衣霉素的敏感性高于親本細胞，原因可能為其糖基化異常，導致基礎內質網(wǎng)應激水平更高.衣霉素通過抑制N-糖基化，進一步提高內質網(wǎng)應激水平，可能克服多藥耐藥胃癌細胞的化療抗性[27].衣霉素通過此機制也抑制頭頸部鱗狀細胞癌的發(fā)展[1].而Yakin等人發(fā)現(xiàn)衣霉素誘導的內質網(wǎng)應激，上調UPR通路中的STAT3和抗凋亡蛋白，促使口腔鱗癌細胞存活[26].衣霉素通過增強內質網(wǎng)應激抗腫瘤的機制可能有賴于衣霉素的糖基化抑制作用，而非由于衣霉素通過未折疊蛋白反應，觸發(fā)內質網(wǎng)應激的作用.

3.7 衣霉素通過調控GRP78影響腫瘤發(fā)展和耐藥產(chǎn)生

衣霉素誘導的GRP78表達及上調內質網(wǎng)應激水平是否能抑制腫瘤發(fā)展尚不明確.GRP78也稱免疫球蛋白重鏈結合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein，BiP），是鈣依賴的葡萄糖調節(jié)蛋白，也是內質網(wǎng)應激標記物，在多種腫瘤中過表達.研究發(fā)現(xiàn)在衣霉素處理的乳腺癌細胞中，GRP78表達量增加，上調內質網(wǎng)應激，抑制腫瘤細胞增殖[17，28].但在甲狀腺癌中，衣霉素誘導的GRP78表達可能促進腫瘤的轉移；GRP78表達下調則抑制衣霉素誘導的內質網(wǎng)應激，并可能逆轉腫瘤細胞的轉移能力[10].Lee等人也認為GRP78表達升高能增強腫瘤侵襲能力，促使耐藥發(fā)生[29].關于GRP78是否表達于細胞表面也有不同觀點.內質網(wǎng)應激水平對于不同腫瘤細胞的影響和作用機制還需進一步研究.

3.8 衣霉素促進腫瘤細胞凋亡

研究表明，衣霉素下調結腸癌細胞的ERK和JNK的表達和磷酸化，抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路，可能通過抑制線粒體凋亡信號通路促進結腸癌細胞凋亡，抑制腫瘤生長和侵襲性[30].此外，衣霉素上調促凋亡Bcl-2家族蛋白Bim和Bid（BH3-interacting domain death agonist），下調抗凋亡蛋白Bcl-xL（B-cell lymphoma extra large）和髓細胞白血病 1（Myeloid cell leukemia-1，MCL1），促進肝癌細胞凋亡[25].衣霉素和順鉑聯(lián)用時減少AKT激活，抑制NF-κB磷酸化，誘導腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）α介導的肺癌細胞凋亡[23].衣霉素和紫杉醇聯(lián)用也增強紫杉醇誘導的乳腺癌細胞凋亡[19].

3.9 衣霉素通過阻滯細胞周期抑制腫瘤細胞增殖

衣霉素顯著抑制細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclindependent kinase，CDK）1、CDK2，阻止結腸癌細胞進入DNA（deoxyribonucleic acid）合成期（S期）和分裂期（M期）[30].衣霉素升高細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物p27蛋白，降低細胞周期蛋白D1，使乳腺癌細胞阻滯于靜止期/DNA合成前期（G0/G1期）.衣霉素還可能誘導肝癌細胞DNA合成后期/分裂期（G2/M期）阻滯[25].

3.10 衣霉素通過恢復攝碘能力增強甲狀腺癌對放射性碘治療的反應性

人B-Raf原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase B-Raf，BRAF）、神經(jīng)營養(yǎng)受體酪氨酸激酶1（neurotrophic receptor tyrosine kinase 1，NTRK1）、RET（rearranged during transfection）等甲狀腺相關基因的表達影響甲狀腺癌細胞的攝碘能力，是放射性核素碘131治療甲狀腺癌的關鍵因素[31].甲狀腺未分化癌的相關基因沉默，細胞喪失攝碘能力，導致對放射性碘治療反應不佳.有研究表明，衣霉素恢復碘代謝相關基因表達，增加鈉-碘同向轉運體、甲狀腺過氧化物酶等蛋白的表達，促進甲狀腺癌細胞對放射性碘的攝取[21].相比于單用衣霉素或者碘131，兩者聯(lián)用顯著抑制腫瘤生長[21].

4 自噬調控腫瘤細胞凋亡

自噬是一種進化上保守的細胞蛋白質降解系統(tǒng)，在減輕細胞異常蛋白積累方面發(fā)揮關鍵作用.自噬誘導形成雙膜囊泡的自噬體，自噬體將細胞蛋白和細胞器轉運至溶酶體降解和再利用，從而減輕內質網(wǎng)應激[32].內質網(wǎng)可以形成自噬體的膜[27].自噬的特征為細胞質空泡和自噬體形成、微管相關蛋白1輕鏈3（Microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）裂解增加和Sequestosome 1（SQSTM1/p62）蛋白水平降低[33].自噬對維持內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)至關重要，內質網(wǎng)應激也可誘導細胞自噬.PERK下游的激活轉錄因子4（Activating Transcription Factor 4，ATF4）控制轉錄，誘導自噬小體形成，而IRE1阻止自噬激活[12].在一定應激狀態(tài)下，自噬維持生物合成的穩(wěn)態(tài)，避免或延遲死亡反應，具有細胞保護功能.SQSTM1與泛素化蛋白聚合物結合，然后經(jīng)自噬降解；抑制自噬時，細胞內SQSTM1積累，泛素/蛋白酶體系統(tǒng)破壞，內質網(wǎng)和線粒體中未折疊蛋白積累，細胞對凋亡敏感[34].細胞損傷嚴重時，自噬促進凋亡[35]，如持續(xù)內質網(wǎng)應激或UPR延長活化會激活促凋亡的Bcl-2家族，導致線粒體凋亡；內質網(wǎng)應激誘導劑衣霉素促使LC3-I轉化為LC3-II，誘導mTOR失活，進而下調AKT/mTOR通路[36]；內質網(wǎng)應激誘導IRE1/JNK/beclin-1調節(jié)的乳腺癌細胞自噬，進而誘導細胞凋亡[37].UPR的三條信號通路都對自噬有顯著意義，UPR與自噬的細胞保護性作用可能促進腫瘤的耐藥性，如衣霉素能誘導乳腺癌細胞自噬，使乳腺癌細胞對低濃度的衣霉素不敏感；降低乳腺癌細胞自噬水平則促進細胞凋亡[37].

5 衣霉素的毒副作用

衣霉素引起的內質網(wǎng)應激可能激活NF-κB介導的肝臟炎癥途徑，誘發(fā)非酒精性脂肪性肝炎[38].衣霉素對正常人體細胞中亦有生長抑制作用.正常胃上皮細胞系對衣霉素比腫瘤細胞系更敏感[27]，低表達HER2的正常乳腺細胞對衣霉素敏感[17].衣霉素非特異性抑制N-糖基化，也可能干擾糖相關代謝.Xiqian Han等人發(fā)現(xiàn)衣霉素的毒副作用是劑量依賴性的，即小劑量應用衣霉素可能是安全的[17].低劑量的衣霉素可能干擾乳腺癌EGFR家族及MAPK、PI3K/AKT通路，提高乳腺癌細胞GRP78表達水平，而不對肝組織產(chǎn)生明顯影響[17].

6 總結

盡管有部分研究表明衣霉素誘導內質網(wǎng)應激，可能促進腫瘤進展，但是衣霉素通過抑制N-糖基化，顯著增強多種腫瘤細胞的治療敏感性.衣霉素降低多個信號通路中的關鍵糖蛋白分子的糖基化水平，如CD44、EGFR和PTX3，明顯下調EGFR家族及其下游PI3K/Akt、MAPK信號通路，Akt/NF-κB信號通路等，促進細胞凋亡.內質網(wǎng)應激水平對腫瘤的影響較不明確，部分研究認為內質網(wǎng)應激可能誘導細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖；也有證據(jù)顯示內質網(wǎng)應激可能通過誘導自噬，增強腫瘤的侵襲性.衣霉素與化療藥物如紫杉醇、曲妥珠單抗、順鉑等聯(lián)用時均逆轉腫瘤細胞耐藥，增加多藥耐藥胃癌細胞、肝癌細胞、甲狀腺未分化癌細胞等的治療敏感性，有望用于輔助治療難治性腫瘤.衣霉素的細胞毒性作用大多表現(xiàn)為劑量依賴性，且缺乏特異性，用于抗腫瘤時對正常組織的毒副作用難以避免.減輕內質網(wǎng)應激、避免過度的未折疊蛋白反應可能緩解衣霉素導致的脂肪性肝炎[39-40]，但其機制是否影響衣霉素抗腫瘤特性需進一步的研究.