張怡，韓雯，王莉，劉浩楠，楊宇星，王春

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院病理科, 新疆 烏魯木齊 830001)

0 引言

隨著人們對自身健康的關(guān)注，越來越多的黑色素瘤患者被發(fā)現(xiàn)，黑色素細(xì)胞是神經(jīng)嵴起源的色素生成細(xì)胞，主要位于基底表皮、毛囊和眼結(jié)構(gòu)中，它們也存在于神經(jīng)系統(tǒng)和黏膜中，異常黑色素瘤細(xì)胞過度增生引起惡性黑色素瘤[1,2]。相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，不同人種間黑色素瘤的發(fā)病率不同，其中白種人最高、黑種人其次、亞洲人較黑種人略低[3]。但是我國黑色素瘤的發(fā)病率也呈上升趨勢，惡性黑色素瘤很早就發(fā)生全身廣泛轉(zhuǎn)移，預(yù)后非常差，80%患者從診斷到死亡往往不超過1 年時間[4,5]，所以我們對黑色素瘤的研究應(yīng)該給予更多的關(guān)注。

受體相互作用蛋白激酶-3(receptor‐ interacting protein kinase 3，RIPK3)是RIPK 家族中的重要一員，作為壞死復(fù)合體(necrosome)的關(guān)鍵成分之一介導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死(necroptosis)的發(fā)生[6]，如果黑色素瘤細(xì)胞得不到正常的程序性壞死，無限增殖，可能會最終導(dǎo)致黑色素瘤的發(fā)生。本研究旨在探討RIPK3 在皮膚黑色素瘤患者中的表達(dá)及對預(yù)后影響的意義。

1 對象和方法

1.1 對象

收集新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院病理科2018 年1 月至2020 年1 月經(jīng)皮膚病理檢查確診為皮膚黑色素瘤患者組織蠟塊30 例，其中男20 例，女10 例；年齡40～75 歲，平均年齡61.9歲。另設(shè)30 例正常皮膚組織作為對照組，其中男18 例，女12 例；年齡41～75 歲，平均年齡60.5 歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 主要試劑

RIPK3 抗體(ab56164)(英國Abcam 公司)；HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗(美國 Santa Cruz 公司)；通用型SP 工作試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；高糖DMEM 培養(yǎng)基(美國Thermo Fisher Scientific 公司)；胎牛血清(FBS)(美國 Biological Industries)；青霉素(華北制藥股份有限公司)；鏈霉素(美國SIGMA 公司)；Trizol(美國Invitrogen)；RNAimax 轉(zhuǎn)染試劑盒(美國Invitrogen)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara 公司)；SYBR 預(yù)混物EX Taq I(日本Takara 公司)；Annexin V -FITC/PI 試劑盒(美國BD 公司)。

1.3 方法

先將組織石蠟進(jìn)行免疫組織化學(xué)處理，進(jìn)行原代表皮角質(zhì)形成細(xì)胞HEKa 培養(yǎng)，在進(jìn)行siRNA 轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證后，用Annexin V-FITC/PI 雙染法流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，最終由兩位實(shí)驗(yàn)人員分別雙盲閱片，按照染色強(qiáng)度和陽性染色細(xì)胞所占百分比進(jìn)行綜合計(jì)分，陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色、棕黃色或褐色顆粒。在400 倍鏡下隨機(jī)選擇5 個視野，每個視野計(jì)數(shù)100 個腫瘤細(xì)胞，觀察細(xì)胞染色的強(qiáng)度，計(jì)算陽性染色細(xì)胞的百分率。其中染色強(qiáng)度分為4 級，無著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。細(xì)胞陽性率＜5%為0 分，5%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分。每個視野陽性細(xì)胞百分率與染色強(qiáng)度相乘即為該視野得分，5 個視野得分的平均值為最終得分?？傆?jì)評分標(biāo)準(zhǔn)為：0 分為陰性(-)；1～4 分為弱陽性(+)；5～8 分為中度陽性(+ +)；9～12 分為強(qiáng)陽性(+ + +)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上所采集數(shù)據(jù)進(jìn)行整理后，采用SPSS 21.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組數(shù)據(jù)陽性率及表達(dá)強(qiáng)度用χ2檢驗(yàn)表示，P＜0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

正常人群組，皮膚組織中RIPK3 表達(dá)在表皮基底層及棘層下部，陽性表達(dá)率93.3%(28/30)；黑色素瘤組，皮膚組織中有3 人RIPK3 蛋白呈弱陽性表達(dá)，其陽性率為10%(3/30)；黑色素瘤組和正常組RIPK3 蛋白在表達(dá)率相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.456，P＜0.05)，并且兩組患者在表達(dá)強(qiáng)度上也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.946，P＜0.05)。

3 討論

全世界最常見的皮膚惡性腫瘤是皮膚惡性黑色素瘤，它是最具侵略性的癌癥之一，更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。黑色素瘤早期可通過淋巴道和血行轉(zhuǎn)移擴(kuò)散到肝臟、肺和大腦等其他器官，終末階段腦轉(zhuǎn)移階段病情進(jìn)展迅速，是患者致死的主要原因；黑色素瘤也是既肺癌和乳腺癌之后最容易發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的第三大原因[7,8]。黑色素瘤早期臨床癥狀復(fù)雜[9,10]，可總結(jié)為“ABCDE 法則”：A：非對稱，色素斑的一半與另一半看起來不對稱。B：邊緣不規(guī)則，邊緣不整或有切跡、鋸齒等，不像正常色素痣那樣具有光滑的圓形或橢圓形的輪廓。C：顏色改變，正常色素痣通常為單色，而黑色素瘤主要表現(xiàn)為污濁的黑色，也可有褐、棕、棕黑、藍(lán)、粉、黑甚至白色等多不同顏色。D：直徑，色素斑直徑＞5～6mm 或色素斑明顯長大時要注意；黑色素瘤通常比普通痣大，要留心直徑＞5mm 的色素斑；直徑大于1cm 的色素痣最好做活檢評估。E：隆起，一些早期的黑色素瘤整個瘤體會有輕微的隆起。臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn)還是皮膚的活組織檢查，首先推薦的是切除活檢，即病灶的完整切除，送病理檢查明確診斷，但是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移需要區(qū)域淋巴結(jié)超聲、胸部CT、全身骨掃描、頭顱的增強(qiáng)MRI 等檢查，有條件的患者也可行PET-CT 檢查[11]。

黑色素瘤年齡分布主要在中青年女性，但男性超過55 歲后發(fā)病率也呈上升趨勢[12]。我國黑色素瘤以肢端和黏膜亞型為主，晚期惡性黑色素瘤，50% ～ 80%的患者可出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，8%～46%的患者可出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移[5]，雖然目前對惡性黑色素瘤的治療取得一定的進(jìn)展，但是惡性黑色素瘤的預(yù)后卻均不盡人意，病人的5 年生存率非常低。黑色素瘤的常規(guī)治療方法包括手術(shù)、化療和放療等，但總體不能顯著改善患者預(yù)后；隨著對黑色素瘤機(jī)制研究的不斷深入及現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，腫瘤靶向治療等新型治療方案給患者帶來了希望；靶向治療通過對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行分析，針對腫瘤細(xì)胞表達(dá)的過程進(jìn)行抑制，以達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞特異性死亡的目的，所以本研究對RIPK3 蛋白在黑色素瘤患者中的作用機(jī)制進(jìn)行研究，為治療惡性黑色素瘤提供分子依據(jù)。

受體相互作用蛋白激酶3(RIPK3)是RIP 激酶家族中的一員，其基因位于染色體14 上，mRNA 編碼518 個氨基酸的多肽。RIPK3 蛋白的N 端是有激酶活性的激酶結(jié)構(gòu)域，C 端是一個退化的基序也稱為RHIM，在其他蛋白分子如RIPK1、TRIF 和DAI 中也有同樣結(jié)構(gòu)的RHIM 基序，RIPK3 可通過這個相同的基序與其他分子發(fā)生相互作用[13]。RIPK3 在淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和NK 細(xì)胞中表達(dá)較高，但在腦、視網(wǎng)膜、肌肉和肝臟等組織中非常低；在急性胰腺炎、缺血性損傷和神經(jīng)退行性病變的動物模型中，RIPK3 蛋白被誘導(dǎo)大量表達(dá)后出現(xiàn)了壞死性凋亡[13]。在NHL 中壞死性凋亡可誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡，因此我們推測RIPK3依賴的壞死性凋亡可能在皮膚惡性黑色素瘤中發(fā)揮作用。

壞死性凋亡(necroptosis)是一種程序性細(xì)胞死亡形式，它和凋亡的不同在于細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡時不會出現(xiàn)典型的凋亡特征，而是和壞死相似，出現(xiàn)早期質(zhì)膜完整性的喪失，細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏和細(xì)胞器腫脹，但與壞死不同的是細(xì)胞可能顯示TUNEL 陽性[15]。細(xì)胞內(nèi)壞死性凋亡的信號由RIPK3 與其上游連接子RIPK1、TRIF 及其下游的MLKL 合作傳遞。當(dāng)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子caspases 被抑制時，壞死性凋亡可以被觸發(fā)，RIPK3激活磷酸化RIPK1 形成復(fù)合物，再激活下游MLKL 轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜使局部質(zhì)膜的完整性不穩(wěn)定，從而介導(dǎo)細(xì)胞死亡[16]。

通過本次研究：正常皮膚組RIPK3 陽性率為93.3%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于黑色素瘤皮膚組的10%，兩者的陽性率差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且在表達(dá)程度上也存在差異，說明在黑色素瘤患者皮膚組織中RIPK3 表達(dá)的降低可能與疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可能是RIPK3 的表達(dá)下降使正常黑色素瘤細(xì)胞的程序性壞死過程被抑制而導(dǎo)致惡性黑色素瘤的發(fā)生。本次實(shí)驗(yàn)研究也存在不足，樣本較少，存在一定偏倚，有待大樣本的進(jìn)一步研究。