鄭丹妮 王夢穎 胡藝涵 劉良忠

(1. 武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2. 武漢食品化妝品檢驗所，湖北 武漢 430012)

納豆是一種由納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)發(fā)酵大豆[1-2]產生的具有拉絲特性[3]的發(fā)酵食品，起源于中國豆豉，于唐代傳到日本后逐漸發(fā)展成一種新型發(fā)酵食品。作為日本消費量最大的發(fā)酵食品，納豆被認為是日本人長壽的“秘方”[4]。2002年，衛(wèi)生部將納豆芽孢桿菌發(fā)酵的納豆列為普通食品進行管理[5]。納豆芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌的亞種[6]，其生長代謝過程中能產生抑菌物質[7]，且對高溫和酸性胃液有一定耐受能力和穩(wěn)定性[8-9]。除含有納豆激酶外，納豆還含有許多生理活性物質[10-12]，如異黃酮、超氧化物歧化酶、皂苷素、生育酚、多種維生素等，使納豆兼具營養(yǎng)性和功能性[13-15]。1987年，日本學者首次提取出納豆激酶[16]，該酶具有良好的溶栓能力，能輔助治療和預防心腦血管疾病[17]。隨著中國社會老齡化的加速，心腦血管疾病逐漸成為高風險疾病，與納豆激酶相關的保健品和食品成為了近年來的熱門研究課題[18-19]。

目前市場上的商品化納豆酶活普遍較低[20]，近年來許多研究側重于單株納豆芽孢桿菌的篩選和優(yōu)化。如利用gyrA基因序列、質譜分析和PCR克隆基因結合的方式鑒定菌株，再結合SDS-PAGE和纖溶活性測定得到高產納豆激酶菌株[21]，以超聲波、超高壓、紫外誘變[22-23]等方式提高單株納豆芽孢桿菌的產酶能力，以進一步提高納豆產品的納豆激酶活力和綜合品質。但是，在納豆發(fā)酵過程中會產生比較明顯的氨臭味[24]，其中的揮發(fā)性鹽基氮與氨臭味大小具有相關性，能反映納豆的氨臭味大小[25]。

研究擬從分離純化保藏的納豆芽孢桿菌中進一步篩選出納豆激酶活力較高的2株納豆菌，采用雙菌發(fā)酵制備納豆，以納豆激酶酶活和揮發(fā)性鹽基氮含量為評價指標，對雙菌株發(fā)酵納豆工藝條件進行優(yōu)化，以期提高納豆激酶酶活的同時降低納豆中令人不喜的氨臭味，獲得品質優(yōu)良的納豆產品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆芽孢桿菌N1、N2、N3、N4、N5、N6：實驗室分離純化[26]后篩選保藏；

非轉基因黃豆：市售；

蛋白胨、酵母提取物、瓊脂、牛肉膏、福林酚：生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司；

氫氧化鈉、氯化鈉、碳酸鈉、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、可溶性淀粉：分析純，上海展云化工有限公司；

酪氨酸：分析標準品，上海源葉生物科技有限公司；

酪蛋白：生化試劑，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;

淀粉培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，可溶性淀粉2%，瓊脂2%，121 ℃滅菌20 min；

LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物0.5%、蛋白胨1%、氯化鈉1%，121 ℃滅菌20 min；

LB固體培養(yǎng)基：酵母提取物0.5%、蛋白胨1%、氯化鈉1%、瓊脂1.5%，121 ℃滅菌20 min；

酪蛋白培養(yǎng)基：A液(牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%)，121 ℃滅菌20 min；B液(干酪素2%)，115 ℃滅菌20 min，使用前A、B液混合。

1.2 主要儀器與設備

多功能臺式離心機：Frontier5000小型，奧豪斯國際貿易(上海)有限公司；

紫外—可見光分光光度計：Evolution220型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

恒溫培養(yǎng)箱：DNP-9052型，上海精宏試驗設備有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：BXM-30R型，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；

落地式恒溫振蕩器：LHZ-111型，上海精宏試驗設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 納豆芽孢桿菌產酶能力篩選 使用保存菌株N1、N2、N3、N4、N5、N6劃線純化3次后，挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h活化2次，將第3代培養(yǎng)液作為發(fā)酵種子液。將種子液稀釋至合適濃度梯度取0.1 mL涂布于淀粉培養(yǎng)基和酪蛋白培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。記錄水解圈直徑與菌落直徑比值(C/H)，3次平行。

1.3.2 納豆芽孢桿菌生長曲線繪制 將活化的種子液接種至液體LB培養(yǎng)基，37 ℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔3 h取樣，稀釋后使用10 mm比色皿測OD660 nm值[27]，無菌LB液體培養(yǎng)基為空白對照。以時間為橫坐標，OD660 nm值為縱坐標繪制生長曲線。

1.3.3 納豆制備 挑選無蟲洞、無裂紋、表面完整、無異色的飽滿黃豆粒，洗凈，按料液比(m納豆∶m蒸餾水)1∶4 (g/mL)加入蒸餾水浸泡24 h，瀝干，121 ℃滅菌20 min。37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h活化種子液兩代，待黃豆冷卻后，按比例加入活化種子液，充分攪勻后置于恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵一定時間，再于4 ℃冰箱中后熟24 h 上述操作均在無菌條件下進行。

1.3.4 酪氨酸標準曲線制作 采用紫外—可見光分光光度法。以吸光度為縱坐標，酪氨酸濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得曲線方程y=0.010 3x-0.003 8，R2=0.999 9。計算OD680 nm值為1時的酪氨酸量(μg)，即為吸光常數K，K=97，在95～100內，試驗數據合理。

1.3.5 納豆浸提液制備 稱取適量納豆按料液比(m納豆∶m蒸餾水)1∶20 (g/mL)加入PBS緩沖液(pH 7.5)，4 ℃下浸提24 h，雙層紗布過濾，4 ℃、5 000 r/min離心20 min，上清液用于酶活分析。

1.3.6 納豆激酶酶活測定 采用福林酚法[28]測定酶活，每組重復3次。按式(1)計算酶活。

(1)

式中：

X——樣品的酶活力，U/g；

A——對應標曲所得樣品最終稀釋液的酶活，U/mL；

t——反應時間，10 min；

m——納豆樣品質量，g；

V——顯色反應體積，4 mL；

n——稀釋倍數。

1.3.7 揮發(fā)性鹽基氮含量(TVB-N值)的測定 采用半微量定氮法。

1.3.8 雙菌發(fā)酵納豆單因素試驗

(1) 菌株質量比對發(fā)酵納豆品質的影響：黃豆蒸煮滅菌冷卻后，接入6%種子液，種子液中兩種菌株質量比(mN5∶mN3)分別為10∶1，5∶1，3∶1，1∶1，1∶3，1∶5，1∶10，37 ℃發(fā)酵24 h，再放入4 ℃冰箱后熟24 h，考察種子液中兩種菌株質量比(mN5∶mN3)對納豆激酶酶活和TVB-N值的影響。

(2) 種子液接種量對發(fā)酵納豆品質的影響：黃豆蒸煮滅菌冷卻后，分別接入2%，4%，6%，8%，10%種子液，種子液中兩種菌株質量比(mN5∶mN3)為1∶1，37 ℃發(fā)酵24 h，再放入4 ℃冰箱后熟24 h，考察種子液接種量對納豆激酶酶活和TVB-N值的影響。

(3) 發(fā)酵時間對發(fā)酵納豆品質的影響：黃豆蒸煮滅菌冷卻后，接入6%種子液，種子液中兩種菌株質量比(mN5∶mN3)為1∶1，37 ℃下分別發(fā)酵20，22，24，26，28 h，再放入4 ℃冰箱后熟24 h，考察發(fā)酵時間對納豆激酶酶活和TVB-N值的影響。

(4) 發(fā)酵溫度對發(fā)酵納豆品質的影響：黃豆蒸煮滅菌冷卻后，接入6%種子液，種子液中兩種菌株質量比(mN5∶mN3)為1∶1，分別于33，35，37，39，41 ℃下發(fā)酵24 h，再放入4 ℃冰箱后熟24 h，考察發(fā)酵溫度對納豆激酶酶活和TVB-N值的影響。

1.3.9 正交優(yōu)化試驗 根據單因素試驗結果選取因素水平，設計L9(34)正交試驗，以納豆激酶酶活為主要指標，輔測TVB-N值，優(yōu)化雙菌株發(fā)酵納豆試驗。

1.4 數據統(tǒng)計分析

使用SPSS軟件進行數據分析，使用Origin軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 產酶能力篩選

由表1可知，各菌株生長過程中的產酶能力存在差異，淀粉培養(yǎng)基的C/H值為1～2，且最高值為(1.75±0.09)，最低值為(1.35±0.14)，說明產淀粉酶能力差異不顯著。酪蛋白培養(yǎng)基的C/H值差距較大，且最高值為(5.64±0.10)，最低值為(2.81±0.07)，說明產蛋白酶能力差異顯著，其中產酶能力較高的菌株為N2、N3、N4、N5。

表1 產酶能力篩選結果Table 1 Screening results of enzyme production capacity

2.2 菌株的生長曲線

由圖1可知，N2、N3、N4、N54株菌株各生長階段較為接近。菌株N6的指數生長期較其他菌株更早結束，12 h 后就進入了生長穩(wěn)定期；菌株N1的指數生長期較其他菌株更為平緩；菌株N3和N5的生長活性較其他菌株更優(yōu)。

圖1 6株菌株的24 h生長曲線圖Figure 1 Growth curve of 6 strains within 24 hours

2.3 納豆芽孢桿菌的篩選

由圖2可知，菌株N1、N2、N6發(fā)酵納豆中的納豆激酶酶活較低，均未超過100 U/g，菌株N3發(fā)酵納豆中的納豆激酶酶活為(218.48±16.47) U/g，菌株N5發(fā)酵納豆中的納豆激酶酶活為(352.25±15.30) U/g，二者的酶活明顯較其他菌株更高。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 不同菌株發(fā)酵對納豆激酶活力的影響Figure 2 Effect of different strains on nattokinase activity

由圖3可知，菌株N5發(fā)酵制備納豆的TVB-N值最高，達(355.43±17.00) mg/100 g；菌株N1和N3發(fā)酵制備納豆的TVB-N值較低，分別為(216.21±11.79)，(219.40±4.92) mg/100 g，二者無顯著性差異?？紤]在提高酶活的情況下降低TVB-N值，菌株N5的TVB-N值最高，但其酶活也最高，菌株N3的TVB-N值較低且酶活較高，因此選取菌株N3和N5進行后續(xù)混合發(fā)酵生產納豆試驗，以探索雙菌株發(fā)酵對納豆發(fā)酵的影響。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 不同菌株發(fā)酵對TVB-N值的影響Figure 3 Effects of different strains on the content of volatile base nitrogen

2.4 單因素試驗

2.4.1 菌株質量比 由圖4可知，當菌株質量比(mN5∶mN3)為3∶1時，納豆激酶酶活達最高(404.40±14.32) U/g，相比N5單菌發(fā)酵提高了14.8%。當菌株質量比(mN5∶mN3)為1∶5，1∶10時，納豆激酶酶活較低，可能是因為菌株N5在混合發(fā)酵中起主要作用，菌株N3在一定比例范圍內起協(xié)同菌株N5發(fā)酵的作用。TVB-N值隨菌株N3比例的增加而降低，最后趨于穩(wěn)定，相比菌株質量(mN5∶mN3)比10∶1和5∶1，當菌株質量比(mN5∶mN3)為3∶1時，TVB-N值有較大幅度降低。說明菌株質量比對納豆激酶酶活和TVB-N值的影響非常顯著(P<0.01)。

2.4.2 接種量 由圖5可知，納豆激酶酶活隨接種量的增加先升高后降低，接種量為8%時達到峰值[(370.28±11.49) U/g]。這可能是因為接種量較低時，菌種生長狀態(tài)不統(tǒng)一，導致發(fā)酵不充分；而超過最高值后，菌液易沉積在底部，且菌體快速發(fā)酵后，衰老期的菌體及其代謝產物堆積，阻礙了后續(xù)的發(fā)酵，影響了納豆激酶的生成。TVB-N值隨接種量的增加逐漸升高，且在接種量為10%時有較大幅度的升高。說明接種量對納豆激酶酶活和TVB-N值的影響非常顯著(P<0.01)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 菌株質量比對發(fā)酵納豆品質的影響Figure 4 Effects of different strain ratios on nattokinase activity

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖5 接種量對發(fā)酵納豆品質的影響Figure 5 Effect of inoculation volume on nattokinase activity

2.4.3 發(fā)酵時間 由圖6可知，納豆激酶酶活隨發(fā)酵時間的增加先升高后降低，發(fā)酵24 h時達最高值[(435.02±18.66) U/g]。當發(fā)酵時間為20 h時，納豆激酶酶活較低，可能是部分納豆菌發(fā)酵不完全，相關物質的生成和酶促反應仍在進行；繼續(xù)延長發(fā)酵時間，部分納豆菌進入衰老期，代謝產物增多，生長環(huán)境逐漸不利于正常代謝，酶促反應逐漸減慢或終止。TVB-N值隨發(fā)酵時間的增加逐漸升高，且在26，28 h時差異不顯著。說明發(fā)酵時間對納豆激酶酶活和TVB-N值的影響非常顯著(P<0.01)。

2.4.4 發(fā)酵溫度 由圖7可知，納豆激酶酶活隨發(fā)酵溫度的升高先升高后降低，發(fā)酵溫度為37 ℃時達最高值[(445.02±14.71) U/g]。這可能是升高溫度能一定程度上促進納豆菌的生長，各種代謝速率都有所提高，產酶能力也隨之提高。溫度過高，部分酶可能失活或活性大幅下降，因此酶促反應速率降低；高溫也可能導致生長過快，代謝產物快速堆積影響納豆激酶合成并降低酶活。TVB-N值隨發(fā)酵溫度的升高而升高，且在39 ℃時有較大幅度的升高。說明發(fā)酵溫度對納豆激酶酶活的影響非常顯著(P <0.01)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖6 發(fā)酵時間對發(fā)酵納豆品質的影響Figure 6 Effect of fermentation time on nattokinase activity

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖7 發(fā)酵溫度對發(fā)酵納豆品質的影響Figure 7 Effect of fermentation temperature on nattokinase activity

2.5 正交試驗

在單因素試驗基礎上，選取菌株質量比(mN5∶mN3)、接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度為變量，進行L9(34)正交試驗，試驗因素水平表見表2，正交試驗結果與分析見表3。

表2 正交試驗因素和水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

由表3可知，各因素對納豆激酶酶活的影響程度大小為A>C>D>B，最高納豆激酶酶活的試驗方案為A1B1C3D1;對揮發(fā)性鹽基氮含量的影響程度大小為D>C>B>A，最低TVB-N值的試驗方案為A2B3C1D1。

表3 正交試驗結果與分析Table 3 Orthogonal test results and analysis

由表4可知，菌株質量比對納豆激酶酶活的影響極顯著(P<0.01)，發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對納豆激酶酶活的影響顯著(P<0.05)，而接種量對納豆激酶酶活的影響不顯著。接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對TVB-N值的影響極顯著(P<0.01)，菌株質量比對TVB-N值的影響顯著(P<0.05)。

表4 各因素對雙菌株發(fā)酵產納品質的方差分析Table 4 Variance analysis of the effects of various factors on the activity of nattokinase produced by two strains

綜合考慮兩個指標及各因素的影響顯著性，總結出較合適的試驗因素組合為A1B3C3D1，即菌株質量比(mN5∶mN3)4∶1，接種量9%，發(fā)酵時間25 h，發(fā)酵溫度35 ℃。在此條件下，進行3次驗證實驗，所得產品納豆激酶酶活為(481.84±19.65) U/g，TVB-N值為(205.21±10.68) mg/100 g。與單菌株N5發(fā)酵產納豆相比，雙菌發(fā)酵的酶活提高了36.8%，TVB-N值降低了42.3%，與單菌株N3發(fā)酵相比，酶活有所提高，但TVB-N值幾乎持平，說明菌株N5和N3共同發(fā)酵作用下，納豆的品質得到了提升。

3 結論

通過篩選出產酶活性較高且活力較好的2株納豆芽孢桿菌，采用雙菌株共同發(fā)酵生產納豆，并對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化。結果表明，發(fā)酵納豆的最適工藝條件為菌株質量比(mN5∶mN3)4∶1，接種量9%，發(fā)酵時間25 h，發(fā)酵溫度35 ℃。此條件下發(fā)酵的納豆揮發(fā)性鹽基氮含量為205.21 mg/100 g，與單菌發(fā)酵最高值相比降低了42.3%，納豆激酶酶活為481.84 U/g，與單菌發(fā)酵最高酶活相比提高了36.8%。TVB-N值仍存在繼續(xù)降低的可能性，針對這一問題，后續(xù)可添加多種食品發(fā)酵常用菌，如酵母、毛霉菌等進行兩種以上菌株混合發(fā)酵，更高質量地優(yōu)化納豆發(fā)酵工藝。