吳嫣艷，任會(huì)旭，馮友龍，張莉，張妤琳

(1.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇 南京 210019； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023)

安神補(bǔ)腦膠囊為2019年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種，處方由鹿茸、制何首烏、淫羊藿、干姜、甘草、大棗、維生素B1組成，具有生精補(bǔ)髓、增強(qiáng)腦力的功效，用于神經(jīng)衰弱、失眠、健忘、頭暈[1-3]。本次抽樣涉及的3個(gè)廠家分別執(zhí)行國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBZ15322009、YBZ08452009、YBZ02542009，均僅有何首烏中所含的2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷的含量測(cè)定項(xiàng)，質(zhì)控不夠全面。本研究參考文獻(xiàn)[4-13]建立了安神補(bǔ)腦膠囊的HPLC指紋圖譜及測(cè)定2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法，為該制劑的整體質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AB高效液相色譜儀，LC solution色譜工作站(日本島津公司)；BS21S 型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.2 試藥

3個(gè)廠家的50批次安神補(bǔ)腦膠囊樣品由國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽樣中各省藥監(jiān)局提供；2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷(批號(hào)110844-201814，質(zhì)量分?jǐn)?shù)91.0%)、淫羊藿苷(批號(hào)110737-201516，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.2%)、甘草酸銨(批號(hào)110731-201720，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.7%)、維生素B1(批號(hào)100390-201806，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.9%)、朝藿定C(批號(hào)111780-201804，質(zhì)量分?jǐn)?shù)92.6%)、大黃素(批號(hào)110756-201512，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.7%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；朝藿定A(批號(hào)R11N7F24698，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%)、朝藿定B(批號(hào)P25F8F30154，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%)、大黃素-8-β-D吡喃葡萄糖苷(批號(hào)P17A10F86138，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%)、大黃素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷(批號(hào)P16N9F75128，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.0%)、淫羊藿次苷Ⅰ(批號(hào)YJ0628SA14，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%)、寶藿苷Ⅰ(批號(hào)R11M8F31212，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%)、大黃素甲醚(批號(hào)T09M9F55482，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%)均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；乙腈、磷酸均為色譜純，水為去離子水，其余均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸銨、維生素B1、朝藿定C、大黃素、朝藿定A、朝藿定B、大黃素-8-β-D吡喃葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿次苷Ⅰ、寶藿苷Ⅰ、大黃素甲醚對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加稀乙醇制成每1 mL分別含10 μg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.4 g，精密稱(chēng)定，置50 mL棕色量瓶中，加稀乙醇40 mL，超聲處理30 min，取出，放冷，定容，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 采用ACE Excel C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.05 mol/L磷酸溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

表1 HPLC指紋圖譜梯度洗脫程序

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，精密吸取20 μL，按“2.1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄色譜圖，導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》，測(cè)得相似度在0.998～1.000之間，表明儀器精密度良好。

2.1.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批安神補(bǔ)腦膠囊，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，各精密吸取20 μL，按“2.1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，測(cè)得相似度在0.998～1.000之間，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)色譜條件于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，測(cè)得相似度在0.999～1.000之間，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 特征峰歸屬 取10批安神補(bǔ)腦膠囊(廠家A 3批、廠家B 3批、廠家C 4批)按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，另吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別精密吸取20 μL，按“2.1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖(見(jiàn)圖1)，各色譜峰歸屬見(jiàn)表2。

注：各色譜峰歸屬見(jiàn)表2。

表2 安神補(bǔ)腦膠囊HPLC指紋圖譜色譜峰歸屬

2.1.6 對(duì)照指紋圖譜的生成 取“2.1.2”項(xiàng)下10批供試品溶液色譜圖，以表2中所述13個(gè)峰為特征峰計(jì)算，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》生成對(duì)照指紋圖譜，見(jiàn)圖2。

2.1.7 相似度評(píng)價(jià) 取50批安神補(bǔ)腦膠囊，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，按“2.1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》，以特征峰計(jì)算，結(jié)果相似度在0.962～0.997之間。

2.2 安神補(bǔ)腦膠囊中3種成分的測(cè)定

2.2.1 溶液的制備

2.2.1.1 混合對(duì)照品溶液 取2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加稀乙醇制成每1 mL分別含50、15、10 μg的混合對(duì)照品溶液，即得(甘草酸質(zhì)量=甘草酸銨質(zhì)量/1.0207)。

圖2 10批安神補(bǔ)腦膠囊指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜(R)的HPLC疊加圖

2.2.1.2 供試品溶液 取內(nèi)容物研細(xì)，取約0.4 g，精密稱(chēng)定，置50 mL棕色量瓶中，加稀乙醇40 mL，超聲處理30 min，取出，放冷，定容，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.1.3 陰性對(duì)照溶液 按處方比例稱(chēng)取除制何首烏、淫羊藿、甘草以外的其他味藥，按制備工藝制成不含制何首烏、淫羊藿、甘草的陰性供試品，按“2.2.1.2”項(xiàng)方法操作，制得不含制何首烏、淫羊藿、甘草的陰性對(duì)照溶液。

2.2.2 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.05 mol/L磷酸溶液為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫(洗脫程序見(jiàn)表3)；流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃，PDA檢測(cè)器；2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm，淫羊藿苷檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，甘草酸銨檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

表3 含量測(cè)定梯度洗脫程序

2.2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，按“2.2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示理論塔板數(shù)按2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷峰計(jì)算均大于5 000，陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

A. 2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷對(duì)照品溶液320 nm； B.淫羊藿苷對(duì)照品溶液270 nm； C.甘草酸銨對(duì)照品溶液250 nm； D～F.供試品溶液320、270、250 nm； G～I(xiàn).陰性對(duì)照溶液320、270、250 nm。

2.2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸銨對(duì)照品適量，加稀乙醇制成濃度分別為0.2、1、2、10、40、80、100、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。按“2.2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)、峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果得到：2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷，y=35 296.910 7x+37 219.281 7，r=0.999 5，線(xiàn)性范圍0.19～190.52 μg/mL；淫羊藿苷，y=20 624.461 9x+ 3 950.279 0，r=0.999 9，線(xiàn)性范圍0.20～197.41 μg/mL；甘草酸(甘草酸質(zhì)量=甘草酸銨質(zhì)量/1.0207)，y=8 175.735 2x+ 3.211 5，r=0.999 9，線(xiàn)性范圍0.19～192.47 μg/mL。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果得到2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸銨峰面積的RSD值(n=6)分別為0.08%、0.10%、0.20%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為190120的樣品，按“2.2.1”項(xiàng)方法制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，結(jié)果得到2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為1.40%、1.29%、1.70%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.6”項(xiàng)下供試品溶液(批號(hào)190120)，在“2.2.2”項(xiàng)色譜條件分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果得到2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸銨峰面積的RSD值(n=8)分別為0.28%、0.25%、1.37%，表明方法穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量樣品(批號(hào)190120)6份，每份精密稱(chēng)取0.2 g，置50 mL棕色量瓶中，精密加入混合對(duì)照溶液(2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸銨濃度分別為1.655 3、0.950 5、0.144 7 mg/mL)1 mL，按“2.2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果測(cè)得2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸銨的平均加樣回收率分別為100.04%、97.33%、97.00%，RSD(n=6)分別為1.43%、1.11%、1.23%，表明方法具有良好的準(zhǔn)確性。

2.2.9 耐用性試驗(yàn) 取批號(hào)為1901072的樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備2份供試品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，色譜柱分別采用Agela Durashell RP C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)、Agilent ZOBAX SB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)、ACE Excel C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，結(jié)果顯示理論板數(shù)按2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷峰計(jì)算均大于5 000，分離度良好，3根色譜柱2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)RSD值分別為0.68%、0.50%、1.91%。

2.2.10 樣品含量測(cè)定 取50批次安神補(bǔ)腦膠囊，按“2.2.1”項(xiàng)方法操作，制備供試品溶液各2份，按“2.2.2”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，結(jié)果測(cè)得50批次安神補(bǔ)腦膠囊樣品中2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍分別為2.4～4.8、0.24～1.96、0.04～0.49 mg/粒，見(jiàn)表4。

表4 各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定結(jié)果

3 討論

近年來(lái)，指紋圖譜廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制研究。本研究建立了安神補(bǔ)腦膠囊的HPLC法指紋圖譜，并對(duì)50批次樣品進(jìn)行了篩查，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)建立了標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，考察樣品的相似度，以期達(dá)到更全面地控制制劑整體質(zhì)量的目的。

安神補(bǔ)腦膠囊由國(guó)家藥品監(jiān)督管理局《國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》(中成藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)部分)內(nèi)科心系分冊(cè)收載的“安神補(bǔ)腦片”改變劑型而來(lái)，方中制首烏補(bǔ)肝腎、益精血、養(yǎng)心安神，淫羊藿補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨，甘草則有調(diào)和諸藥的功效。本文結(jié)合安神補(bǔ)腦膠囊處方制法，參考《中國(guó)藥典》2015年版一部收栽的制何首烏、淫羊藿、甘草的含量測(cè)定項(xiàng)目[1]，分別選擇2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸3種成分建立含量測(cè)定方法，以有效控制安神補(bǔ)腦膠囊制劑質(zhì)量。

對(duì)50批安神補(bǔ)腦膠囊樣品中2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)圖4?？梢?jiàn)，淫羊藿苷與甘草酸2個(gè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)企業(yè)之間的差異較大。原法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，均僅有何首烏中所含的2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷的含量測(cè)定項(xiàng)，而對(duì)淫羊藿與甘草酸沒(méi)有進(jìn)行控制。本文建立安神補(bǔ)腦膠囊HPLC指紋圖譜，同時(shí)測(cè)定2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸3種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，該方法準(zhǔn)確、靈敏、可靠，為安神補(bǔ)腦膠囊的質(zhì)量控制提供了依據(jù)，對(duì)原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了提升。

A. 2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷； B.淫羊藿苷； C.甘草酸)。