潘倩羽 楊潤(rùn)昭 李 俊 康彩霞

(華東交通大學(xué)土木建筑學(xué)院，江西 南昌 330013)

引言

沉水植物是水生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級(jí)生產(chǎn)力，對(duì)水體中的重金屬和氮磷都有良好的富集效果[1-4]，但近年來隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，鄱陽湖各入湖河流收納了大量的城鎮(zhèn)生活污水和工農(nóng)業(yè)廢水，輸入了較多的營(yíng)養(yǎng)鹽和重金屬物質(zhì)，導(dǎo)致了鄱陽湖水質(zhì)的惡化[5]，而過量的重金屬也會(huì)對(duì)沉水植物造成嚴(yán)重生理脅迫。目前對(duì)鄱陽湖的水質(zhì)研究主要集中在富營(yíng)養(yǎng)化，調(diào)查中發(fā)現(xiàn)龍口近年來受頻繁的采砂活動(dòng)影響甚嚴(yán)重，加劇了湖區(qū)的重金屬污染，在相關(guān)文獻(xiàn)中也提到鄱陽湖主要入湖口重金屬元素呈復(fù)合污染，其中沉積物中重金屬Cu污染程度最高[6]，而底泥中可提取態(tài)的重金屬占總量比例越高，重金屬越易釋放造成二次污染[7]。鄱陽湖區(qū)土壤中Cu含量分布差異較大，最高值為342.54mg/kg，位于蔡家灣。最低值為6.83mg/kg，位于都昌[8]。目前相關(guān)研究表明，60μM Cu2+能抑制擬南芥合成生長(zhǎng)素的吲哚-3-丙酮酸途徑中TAA1和YUCCA家族基因的表達(dá)，從而使得根尖生長(zhǎng)素含量減少，抑制主根生長(zhǎng)[9]；在相同處理時(shí)間條件下，隨著銅濃度的增大，檸檬香蜂草的SOD以及葉綠素含量均表現(xiàn)低促高抑的趨勢(shì)[10]；Cu2+濃度為≤200mg/kg可促進(jìn)香椿的生長(zhǎng)，隨著Cu2+濃度的升高，可溶性蛋白含量先降低后升高而后又下降[13]。重金屬Cu是植物必需的微量元素之一，是一些酶(如多酚氧化酶、抗壞血酸氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD))的成分，可以影響氧化還原過程，還存在于葉綠體的質(zhì)體藍(lán)素中，參與光合作用的電子傳遞體系，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起著十分重要的作用[11]。目前研究表明，鄱陽湖濕地沉水植物以苦草為廣布種，但近年來的鄱陽湖水質(zhì)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，各區(qū)域水質(zhì)呈下降趨勢(shì)，一定程度上導(dǎo)致了沉水植物的減少[12]。本實(shí)驗(yàn)以苦草為實(shí)驗(yàn)材料，著重研究其對(duì)底泥中重金屬銅的生理響應(yīng)，旨在為近年來鄱陽湖水生態(tài)系統(tǒng)沉水植物的保護(hù)提供依據(jù)，并為進(jìn)一步探索沉水植物對(duì)重金屬污染的早期預(yù)警和耐性機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

苦草(Vallisneria Asiatica)冬芽于一月上旬采自鄱陽湖，帶泥培養(yǎng)在鄱陽湖星子站濕地實(shí)驗(yàn)室中。存儲(chǔ)一段時(shí)間，待發(fā)芽后一個(gè)半月，選取長(zhǎng)勢(shì)良好且一致的植株，用自來水沖洗干凈，染毒前一周對(duì)其馴化。底泥采自鄱陽湖星子站未受重金屬污染泥土，過2 mm孔徑篩，混合均勻備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

實(shí)驗(yàn)設(shè)置在潘陽湖星子站室外，將苦草水深環(huán)境設(shè)為1.5m，并設(shè)置三組平行實(shí)驗(yàn)。每組底泥分別加入CuSO4·5H2O，使底泥中w(Cu)分別為50mg/kg，80mg/kg，150mg/kg，250mg/kg。為防止底泥中的重金屬進(jìn)入上部覆水，在每個(gè)塑料桶底泥表面平鋪2cm細(xì)沙。每個(gè)塑料桶種6株苦草，用尼龍繩將這些塑料桶分別固定于兩個(gè)2m×2m×2m的水池。實(shí)驗(yàn)從2018年6月11日開始，計(jì)為0d采樣，在第19d結(jié)束試驗(yàn)并采樣。實(shí)驗(yàn)期間采用自然光照，排除光照不足，病蟲害等因素對(duì)苦草生長(zhǎng)的影響。取樣的植株洗凈后，用紙擦干植物表面水分，取每株相同部位的苦草葉片，測(cè)定葉片葉綠素a，過氧化物酶(POD)比活力，超氧化物歧化酶(SOD)，可溶性蛋白含量(SP)。

從樣品剪取苦草葉片，稱取約0.2g葉片組織，放入冰水預(yù)冷的研缽中，以液氮冷凍，加入1 mL的50 mmol·L-1PBS(磷酸緩沖鹽溶液 Phosphate buffer saline)(pH 7. 8)研磨均勻，再加入3 mL上述PBS緩沖液，倒入4 mL離心管，于4 ℃條件下12 000xg離心20 min，上清液即為粗酶提取液。

SOD活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法[13]。在3mL反應(yīng)液中含有130mmol/L甲硫氨酸、750μmol/L NBT、20μmol/L 核黃素、100 μmol/L EDTA-2Na、50mmol/L 磷酸緩沖液(pH7.5)、待測(cè)酶液(空白以緩沖溶液代替，以不對(duì)照光的管作調(diào)零)，在4000lx光下照射20min后，NBT光化還原產(chǎn)物藍(lán)色甲腙在560 nm有最大吸收，在此條件下，反應(yīng)被抑制50%所需酶量為1個(gè)活力單位。

POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法。該方法參照Tsibris[14]等人的方法，將2.3mL的10 mmol/L Tris-HCl緩沖液(內(nèi)含0.50mol/L CaCl)、0.5mL的78 mmol/L愈創(chuàng)木酚和0.1mL的待測(cè)酶液樣品充分混合，最后加入0.2mL的4.5mmol/L H2O2溶液，反應(yīng)3 min，在波長(zhǎng)470 nm 處測(cè)定吸光度值。吸光度值每分鐘變化0.01個(gè)單位記為1U。

可溶性蛋白(SP)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法。該方法參照王艾平，周麗明[15]的優(yōu)化方法，取待測(cè)液1.0mL，加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液(0.01%)4.0mL，以蒸餾水補(bǔ)至總體積為10.0mL，混勻，25℃條件下放置35min，于595nm處測(cè)定其吸光度。

葉綠素含量測(cè)定采用分光光度法。取1g樣品，加入10 mL純丙酮及少許CaCO3(中和酸性，防止葉綠素酯酶分解葉綠素)和石英砂，研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入離心管，用適量80%丙酮洗滌研缽，定容15ml后，取4ml(5ml，或10ml也行)離心。12000 xg離心10 min。取上清液(色素提取液)1.5 mL，加80%丙酮1.5 mL，空白為80%丙酮，測(cè)定663nm、645nm處的吸光度A663、A645。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。使用SPSS軟件(SPSS 19.0 for Windows)對(duì)同一染毒時(shí)間各處理組與對(duì)照組之間某指標(biāo)平均值進(jìn)行方差分析(one-way ANOVA，LSD檢驗(yàn))。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同Cu2+濃度對(duì)苦草生長(zhǎng)影響

由表1可知，在銅離子濃度小于80mg/kg時(shí)，苦草葉片逐漸變寬，長(zhǎng)勢(shì)逐漸良好。當(dāng)銅離子為150mg/kg時(shí)新生葉片較少，顏色深綠。在銅離子為250mg/kg時(shí)植株矮小。

表1 不同銅離子濃度下苦草的生長(zhǎng)狀況

2.2 不同Cu2+濃度對(duì)苦草葉片葉綠素含量的影響

由圖1可知，實(shí)驗(yàn)過程中苦草葉片中葉綠素隨Cu2+濃度增加先出現(xiàn)上升，然后下降恢復(fù)正常穩(wěn)定值。當(dāng)Cu2+濃度處于50mg/kg時(shí)葉綠素量達(dá)到最大值，隨后葉綠素量隨著Cu2+濃度的增加逐漸下降最終趨于穩(wěn)定。

圖1 不同銅離子濃度下苦草的葉綠素含量

2.3 不同Cu2+濃度對(duì)苦草葉片可溶性蛋白含量的影響

由圖2可知，苦草葉片中可溶性蛋白含量(SP)隨著Cu2+濃度的增加先增加最后逐步下降，在Cu2+濃度為80mg/kg時(shí)達(dá)到最大值，隨后可溶性蛋白含量(SP)隨著Cu2+濃度增加逐漸降低。

圖2 不同銅離子濃度下苦草的可溶性蛋白含量

2.4 不同Cu2+濃度對(duì)苦草葉片POD含量的影響

由圖3可知，隨著 Cu2+濃度增加，苦草葉片中POD含量逐漸增加，但過量Cu2+濃度又會(huì)使POD含量降低。Cu2+濃度為150mg/kg時(shí)POD含量達(dá)到最大值，隨后POD含量開始隨著Cu2+濃度的增加而下降。由此可見，低濃度Cu2+對(duì)苦草葉POD 產(chǎn)量有所提高，高濃度有所抑制。

圖3 不同銅離子濃度下苦草的POD活性

2.5 不同Cu2+濃度對(duì)苦草葉片SOD含量的影響

由圖4可知，隨著Cu2+濃度增加，SOD含量增加，當(dāng) Cu2+濃度為80mg/kg和Cu2+濃度為150mg/kg時(shí)SOD含量達(dá)到最大值并基本保持不變，隨后在Cu2+濃度為250mg/kg時(shí)SOD含量下降。由此可見，低濃度Cu2+對(duì)苦草葉SOD 產(chǎn)量有所提高，高濃度有所抑制。

圖4 不同銅離子濃度下苦草的SOD活性

3 討論

Cu是植物有機(jī)體必需的一種金屬元素，微量的Cu對(duì)生物體有積極作用，如Cu存在于葉綠體的質(zhì)體藍(lán)素中，參與光合作用的電子傳遞體系，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起著十分重要的作用，并且作為SOD的重要輔基，Cu對(duì)清除氧自由基以保護(hù)細(xì)胞有重要作用[16]，可見，低濃度Cu2+有助于植物的生長(zhǎng)。從實(shí)驗(yàn)分析來看，在低濃度Cu2+環(huán)境下，Cu2+參與光合作用電子傳遞體系[16]，苦草的生長(zhǎng)可以得到促進(jìn)。在本實(shí)驗(yàn)中，SOD和POD的活性出現(xiàn)一定程度的升高，這是植物體的保護(hù)性反應(yīng)，能有效地清除毒害所產(chǎn)生的活性氧。但抗氧化能力有限，一旦Cu2+濃度過高，活性氧的動(dòng)態(tài)平衡被打破，產(chǎn)生了大量剩余活性氧，則其對(duì)苦草就會(huì)造成氧化損傷，苦草光合作用功能下降[17]，葉綠素、可溶性蛋白含量較對(duì)照組含量而言都有所下降，這說明高濃度Cu2+會(huì)對(duì)苦草產(chǎn)生脅迫，影響苦草生長(zhǎng)。

3.1 苦草的代謝反應(yīng)

經(jīng)過19d處理后，苦草內(nèi)葉綠素含量有小幅度上升，表明低濃度Cu2+可促進(jìn)苦草生理代謝。但當(dāng)Cu2+濃度處于較高階段，葉綠素含量驟然下降，且與對(duì)照組葉綠素含量相比，有所下降。銅是一些金屬蛋白酶(例如：SOD、POD)的結(jié)構(gòu)元素，其參與植物重要的生物過程，如光合作用、呼吸、氧化超氧化物清除等，但過量的銅會(huì)導(dǎo)致植物生物量減少、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，甚至引起萎黃病和壞死[18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高濃度Cu2+會(huì)抑制苦草新陳代謝。光合作用是植物體內(nèi)較為重要的代謝過程，其強(qiáng)弱對(duì)植物生長(zhǎng)及抗逆性具有十分重要的影響，并且葉綠素的高低在很大程度上反映了植物的生長(zhǎng)狀況和光合作用效率[19]。銅作為植物生命活動(dòng)的微量元素，當(dāng)其濃度較低時(shí)能夠促進(jìn)光合作用，反之則抑制。過量的銅會(huì)改變?nèi)~綠體或類囊體的結(jié)構(gòu)，甚至?xí)?dǎo)致植物生物量減小，細(xì)痩萎黃，銅和D1蛋白的絡(luò)氨酸殘基相結(jié)合，可抑制光系統(tǒng)II(PSⅡ)的電子傳遞[20]，或?qū)е录?xì)胞色素b559氧化還原端的改變[21]，光合作用所儲(chǔ)存的能量減少，光合電子傳遞降低，導(dǎo)致生物量減少[22]，銅脅迫使葉綠素含量大幅下降，24 h內(nèi)使初始熒光(Fo)和最大熒光(Fm)升高，特別是Fm可能出現(xiàn)負(fù)值，表明光合器官己受到破壞[23]，致使光合作用效率降低、葉綠素含量下降。植物新陳代謝所涉及到的酶大多屬于蛋白質(zhì)，而本實(shí)驗(yàn)所測(cè)的可溶性蛋白含量在低濃度Cu2+環(huán)境下會(huì)有一定幅度的上升，但隨著Cu2+濃度處于較高階段時(shí)，植物體內(nèi)可溶性蛋白含量逐步下降，說明在高濃度Cu2+環(huán)境，苦草受到了重金屬脅迫。

3.2 苦草的抗氧化反應(yīng)

銅是一種具有氧化還原性的金屬，Cu2+過量后表現(xiàn)為高毒性，會(huì)對(duì)植物體產(chǎn)生氧化脅迫，形成有害的活性氧(ROS)，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)催化芬頓(Fenton)反應(yīng)生成羥基自由基，導(dǎo)致脂類、蛋白質(zhì)和DNA損害[24]，導(dǎo)致植物出現(xiàn)生物量減少、根系生長(zhǎng)受抑制及萎黃病、燙傷、壞死等癥狀[25]。但植物可通過過酶和非酶抗氧化系統(tǒng)保護(hù)其自身免受氧化損傷，其中用于清除ROS的酶包括SOD和POD等，它們分布在植物細(xì)胞的不同位點(diǎn)上，相互協(xié)作清除體內(nèi)ROS[9]。本實(shí)驗(yàn)中銅處理后苦草中SOD含量以及POD含量隨著Cu2+濃度的增加不斷上升，但當(dāng)Cu2+濃度處于250 mg/kg時(shí)二者含量下降。該情況說明，在脅迫條件下時(shí)，植物體ROS的產(chǎn)生和清除平衡遭到破壞，加速了ROS的積累，進(jìn)而影響植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育。植物通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的抗氧化物酶系抵抗Cu2+脅迫，當(dāng)Cu2+濃度超過植物耐銅閾值時(shí)，其抗氧化物酶系被破壞。

4 結(jié)論

通過上述分析得出，在高濃度Cu2+環(huán)境，苦草會(huì)受到重金屬脅迫，但其可提高SOD、POD等活性來抵御脅迫。同時(shí)苦草SOD含量受Cu2+濃度影響較為明顯，在Cu2+濃度升高的每一個(gè)階層，SOD含量的增幅較大。因此，相較于一般沉水植物脅迫研究中，選用SPD比活性指標(biāo)來衡量植物脅迫程度更具時(shí)效性，可作為進(jìn)一步探索沉水植物對(duì)重金屬污染的早期預(yù)警。但當(dāng)Cu2+濃度超過植物耐銅閾值時(shí)，其抗氧化物酶系被破壞，對(duì)苦草生長(zhǎng)產(chǎn)生一定損傷。因此，在工農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展的同時(shí)，合理回收利用重金屬對(duì)鄱陽湖生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)具有重要意義。