李啟成，虞大為，宗靜，朱江磊，徐東升，王忠祥，王詩波

解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第904醫(yī)院 a.急診科；b.消化內(nèi)科；江蘇 無錫 214100

膿毒癥是指由感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，可累及多個(gè)系統(tǒng)和器官，進(jìn)而導(dǎo)致患者死亡[1]。其中，膿毒癥引起的急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，病死率高[2-3]。研究表明，AKI的早期發(fā)現(xiàn)及治療可減少患者的死亡[4]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA[5]，研究證實(shí)其影響人體內(nèi)關(guān)鍵代謝途徑[6]、病理進(jìn)程[7]，進(jìn)而在細(xì)胞增殖、分化、凋亡及應(yīng)激反應(yīng)[8]等方面發(fā)揮重要作用。miR-203在不同的器官組織、腫瘤中具有差異性表達(dá)，例如膀胱癌[9]、胃癌[10]、大腸癌[11]、肺癌[12]、乳腺癌[13]等，但目前鮮有報(bào)道m(xù)iR-203的異常表達(dá)與膿毒癥大鼠急性腎損傷間的關(guān)系。本研究將探討miR-203對(duì)膿毒癥大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用，以期為臨床早期干預(yù)膿毒癥急性腎損傷提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康的SPF級(jí)雄性成年SD大鼠購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（豫）2014-0002]，體重200±50 g，于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室用無菌水和飼料飼養(yǎng)1周后進(jìn)行造模處理。

Keygen Trans新型轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；miRNA qRT-PCR檢測(cè)試劑盒、cDNA合成試劑盒購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司；改良HE染色試劑盒、高效RIPA裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；miR-203 agomir、agomir-NC由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成；大鼠肌酐（Cr）ELISA定量檢測(cè)試劑盒、大鼠尿素氮（BUN）ELISA試劑盒、大鼠腎損傷分子1（KIM-1）ELISA試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；大鼠中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL）ELISA試劑盒購(gòu)自上?？道噬锟萍加邢薰?；大鼠白介素1β（IL-1β）ELISA試劑盒購(gòu)自安徽經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；β-actin抗體（ab6276，小鼠單克隆抗體）、Toll樣受體4（TLR4）抗體（兔多克隆抗體）、磷酸化p65（p-p65）抗體（兔多克隆抗體）、山羊抗兔IgG H&L（HRP）、山羊抗小鼠IgG H&L（HRP）購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；磷酸化NF-κB（p-IκBα）抗體（小鼠單克隆抗體）購(gòu)自美國(guó)圣克魯斯生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及建模

將40只SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、miR-203 agomir組、agomir-NC組，每組10只，通過盲腸結(jié)扎穿刺法（CLP）建立膿毒癥大鼠模型。miR-203agomir、agomir-NC組模型建立后分別尾靜脈注射miR-203 agomir和agomir-NC，每次10 nmol/L，模型組和假手術(shù)組注射等量的生理鹽水，24 h后檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)變化情況。

1.3 RT-qPCR檢測(cè)miR-203表達(dá)水平

提取大鼠腎組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-qPCR測(cè)定miR-203表達(dá)水平，U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)。miR-203正向引物為5′-ACACTCCAGCTGGGGTGAAATGTTTA-3′，反向引物為 5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6 正向引物為 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 15 min，然后按 95℃ 5 s、60℃ 30 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。

1.4 ELISA檢測(cè)血清腎功能指標(biāo)、腎損傷指標(biāo)、炎性指標(biāo)

收集全血標(biāo)本，4℃、1000 r/min離心20 min，收集上清。將ELISA檢測(cè)試劑盒于室溫條件下平衡20 min，標(biāo)準(zhǔn)孔中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，樣本孔中加入待測(cè)樣本50 μL；每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃孵育60 min；棄上清，加入350 μL洗滌液，室溫孵育1 min；棄上清，上述步驟重復(fù)5次；每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min；每孔加入50 μL終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的D450nm值。

1.5 HE染色觀察各組大鼠腎組織病理變化

SD大鼠造模成功24 h后麻醉處死。取腎組織，4%多聚甲醛固定后進(jìn)行梯度無水乙醇脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟，用蘇木精-伊紅溶液染色，脫水，中性樹脂封片。光學(xué)顯微鏡觀察大鼠腎組織的病理變化。

1.6 Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

組織勻漿后用RIPA裂解液提取各標(biāo)本的總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。配制分離膠和濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE。轉(zhuǎn)PVDF膜后加入5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉，然后加入一抗（1∶1000），4℃過夜孵育；加入二抗（1∶3000），室溫孵育1 h；洗膜后用ECL發(fā)光液顯影，采用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組數(shù)據(jù)之間比較采用F檢驗(yàn)，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠miR-203表達(dá)水平

與假手術(shù)組比，模型組和agomir-NC組大鼠腎組織miR-203表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）；與agomir-NC組比，miR-203 agomir組大鼠腎組織miR-203表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），提示轉(zhuǎn)染成功（圖1）。

2.2 各組大鼠血清中腎功能及腎損傷標(biāo)志物含量

與假手術(shù)組比，模型組和agomir-NC組大鼠血清Cr、BUN、NGAL、KIM-1含量均顯著升高（F值依次為36.249、124.320、38.819、260.307，P＜0.05）；與agomir-NC組比，miR-203 agomir組大鼠血清Cr、BUN、NGAL、KIM-1含量均顯著下降（t值依次為5.650、8.559、7.498、16.797，P＜0.05）（圖2）。

2.3 各組大鼠血清炎性因子含量

與假手術(shù)組比，模型組和agomir-NC組大鼠血清TNF-α、IL-1β含量均顯著升高（F值分別為248.561、91.946，P＜0.05）；與agomir-NC組比，miR-203 agomir組大鼠TNF-α、IL-1β含量均顯著下降（t值分別為16.926、7.516，P＜0.05）（圖3）。

2.4 各組大鼠腎組織病理變化

假手術(shù)組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常；模型組和agomir組大鼠腎組織細(xì)胞水腫，伴有炎性浸潤(rùn)、腎小球皺縮、腎小管閉塞；miR-203 agomir組大鼠腎組織水腫、炎性浸潤(rùn)以及腎小球和腎小管病變情況均得到緩解（圖4）。

2.5 miR-203對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響

與假手術(shù)組比，模型組和agomir-NC組大鼠腎組織 TLR4、p-p65、p-IκBα蛋白表達(dá)水平顯著升 高（P＜0.05）；與 agomir-NC 組 比 ，miR-203 agomir組大鼠腎組織TLR4、p-p65、p-IκBα蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）（圖5）。

圖1 各組大鼠miR-203表達(dá)水平

圖2 各組大鼠血清中腎功能及腎損傷標(biāo)志物含量

3 討論

圖3 各組大鼠血清炎性因子含量

30%～50%膿毒癥患者會(huì)發(fā)生膿毒癥急性腎損傷，這是常見的并發(fā)癥之一，具有病情危重、臨床治療不佳、致死率高等特征[14]。已有研究表明，異常表達(dá)的miR-203在多種類型的癌癥中扮演著抑癌的角色。Shen等[9]發(fā)現(xiàn)miR-203可能通過負(fù)調(diào)控組織轉(zhuǎn)錄因子Twist同系物1（Twist1）而在膀胱癌細(xì)胞中充當(dāng)腫瘤抑制性miRNA。Du等[11]研究表明miR-203通過靶向重組人帕金森病蛋白7（DJ-1，PARK7）抑制大腸癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Chen等[15]發(fā)現(xiàn)miR-203通過靶向脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）抑制肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。本研究通過RT-qPCR檢測(cè)各組大鼠腎組織miR-203表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比，模型組和agomir-NC組大鼠腎組織miR-203表達(dá)水平顯著下降；與agomir-NC組比，miR-203 agomir組大鼠腎組織miR-203表達(dá)水平顯著升高。這提示miR-203在膿毒癥急性腎損傷發(fā)生發(fā)展中扮演著抑癌作用。

HE染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比，模型組和agomir-NC組大鼠腎組織細(xì)胞水腫，且伴有炎性浸潤(rùn)、腎小球皺縮；過表達(dá)miR-203后，腎組織水腫、炎性浸潤(rùn)及腎小球皺縮均得到顯著改善。Cr和BUN是判斷腎功能損害的重要指標(biāo)，在急性腎損傷中高表達(dá)[16]；KIM-1和NGAL是急性腎損傷的重要生物標(biāo)志物，在急性腎損傷早期高表達(dá)[17]。Han等[18]研究表明虎杖和肉桂通過降低Cr、BUN、NGAL、KIM-1水平并抑制肝黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）表達(dá)進(jìn)而改善高尿酸血癥大鼠生物腎臟功能。通過ELISA實(shí)驗(yàn)觀察各組大鼠腎功能指標(biāo)Cr與BUN的變化，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比，模型組和agomir-NC組血清Cr、BUN、NGAL、KIM-1水平均顯著升高；過表達(dá)miR-203后，血清 Cr、BUN、NGAL、KIM-1水平均顯著下降。這提示miR-203能夠降低膿毒癥急性腎損傷的腎功能損害程度。

圖4 各組大鼠腎組織病理變化（200×）

圖5 miR-203對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響

IL-1β和TNF-α是膿毒癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的重要炎性因子，是反映機(jī)體炎癥程度的指標(biāo)[19]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比，血清IL-1β、TNF-α水平均顯著升高；過表達(dá)miR-203后，血清IL-1β、TNF-α水平均顯著下降。這提示miR-203可能通過抑制炎癥反應(yīng)而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

王彬等[20]研究表明，在實(shí)驗(yàn)性重度急性胰腺炎組織中的TLR4、NF-κB p65表達(dá)變化與腎損傷嚴(yán)重程度和促炎因子的變化一致。Zhang等[21]研究表明Tec激酶的負(fù)調(diào)控通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性腎臟損傷。Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)棕櫚酸通過激活 TLR4/Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子（KLF7）/NF-κB炎性信號(hào)促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)。Li等[23]研究表明紅景天苷通過抑制TLR4/NF-κB和MAPK信號(hào)通路，并減少炎性細(xì)胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α的釋放，進(jìn)而改善腎間質(zhì)纖維化。李登等[24]研究表明miR-203通過下調(diào)TLR4-Myd88-NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比，模型組和agomir-NC組腎組織TLR4、p-p65、p-IκBα水平均顯著升高；過表達(dá)miR-203后，腎組織 TLR4、p-p65、p-IκBα水平均顯著下降。這提示miR-203對(duì)膿毒癥急性腎損傷的保護(hù)作用是通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路起作用的。

綜上所述，本研究表明miR-203在膿毒癥急性腎損傷的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮一定的作用，miR-203在其中呈低表達(dá)水平，miR-203能夠抑制炎癥反應(yīng)，對(duì)膿毒癥急性腎損傷大鼠起到保護(hù)作用，其機(jī)制可能與miR-203抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。miR-203可作為膿毒癥急性腎損傷中的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物，對(duì)臨床診斷及療效判定等方面具有重要的意義。