汪賢竹 張 菁

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院藥學(xué)部，浙江杭州 310016

混合性癡呆（mixed dementia，MxD）是指患者同時(shí)患有阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）和腦血管?。╟erebrovascular disease，CVD），臨床上既表現(xiàn)有神經(jīng)退行性變，也存在腦血管性病理改變的疾病[1]。以上這兩種病變既可單獨(dú)導(dǎo)致癡呆的發(fā)生，也可以相互作用，影響癡呆的進(jìn)程[2]。然而上述兩種病變發(fā)揮協(xié)同作用的機(jī)制仍不清楚，因此，急需建立一種能有效模擬人類MxD發(fā)病及病理特點(diǎn)的動(dòng)物模型。近年來(lái)關(guān)于MxD動(dòng)物模型的研究日漸增多，并取得了一定進(jìn)展，本文對(duì)MxD動(dòng)物模型進(jìn)行綜述。

相較于血管性癡呆（vascular dementia，VaD），根據(jù)其病理特點(diǎn)，AD已發(fā)展出很多成熟的動(dòng)物模型。神經(jīng)細(xì)胞β-淀粉樣前體細(xì)胞[myloid beta （A4） precursor protein，APP]由于變異，可在錯(cuò)誤的位置經(jīng)酶切后會(huì)形成淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ），成為AD的特征性病理改變[3]。利用基因工程的方法將人源性APP（野生或突變）基因?qū)胄∈笾?，使其過(guò)表達(dá)，就會(huì)引起Aβ沉積異常、tau蛋白異常磷酸化、腦淀粉樣血管病、腦萎縮、神經(jīng)元凋亡、認(rèn)知缺陷和行為障礙等神經(jīng)退行性改變癥狀[4]。目前APP轉(zhuǎn)基因小鼠模型，如PDAPP、Tg2576、APP23、CRND8，均已廣泛應(yīng)用于AD的實(shí)驗(yàn)研究。而腦血管病變的模式動(dòng)物可按模擬腦血管病的成因分為缺血型、高血壓型、糖尿病型等類型。兩種疾病模型的有機(jī)結(jié)合就形成了MxD的動(dòng)物模型。

1 缺血-AD模型

1.1 慢性低灌注-AD模型

APP23小鼠是過(guò)表達(dá)人APP751突變基因（Swedish 2個(gè)點(diǎn)突變K670N、N671L）AD的模式動(dòng)物[5]。對(duì)APP23小鼠行雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)，以逐步降低腦血流量來(lái)模擬腦血管病變的作用[6]。結(jié)果顯示，與包括野生型假手術(shù)組小鼠以及APP23假手術(shù)組在內(nèi)的對(duì)照組相比，低灌注-APP23組小鼠tau蛋白磷酸化和α-突觸核蛋白磷酸化顯著增高。表明缺血損傷促進(jìn)了AD小鼠神經(jīng)退行性病理特征。另外，低灌注-APP23組小鼠血管壁上MMP-9顯著激活，表明該模型存在嚴(yán)重的血腦屏障損傷，神經(jīng)血管重塑加劇。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）是 Neurotrophin家族的成員，在神經(jīng)元生長(zhǎng)和存活中起重要的作用，被認(rèn)為和認(rèn)知能力有關(guān)[7]。低灌注-APP23組小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中BDNF表達(dá)量顯著降低。

綜上，該模型操作簡(jiǎn)單，既模擬了MxD中血管病變的因素，也涉及了AD相關(guān)的病理改變，但該研究只關(guān)注了神經(jīng)病理學(xué)上的變化，包括從BDNF上的間接體現(xiàn)，但缺點(diǎn)是未檢測(cè)能直接體現(xiàn)認(rèn)知功能變化的指標(biāo)，如認(rèn)知行為學(xué)的改變。

1.2 MCAO-AD模型

該模型的腦血管病變是通過(guò)在小鼠中進(jìn)行遠(yuǎn)端大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）加缺氧構(gòu)建。吸入異氟烷麻醉的小鼠，在顳肌處切開(kāi)切口，在肌肉中創(chuàng)建了一個(gè)口袋以露出下面的頭骨，并確定大腦中動(dòng)脈的位置。使用微鉆頭來(lái)暴露下面的大腦中動(dòng)脈。切開(kāi)腦膜，并使用小血管燒灼器對(duì)血管進(jìn)行燒灼。最后，使用手術(shù)膠封閉傷口。手術(shù)后立即將小鼠置于含有9%氧氣和91%氮?dú)獾目臻g內(nèi)45 min。除大腦中動(dòng)脈燒灼外，假手術(shù)小鼠進(jìn)行了相同的手術(shù)步驟，并且在手術(shù)后45 min內(nèi)也接受了9%的氧氣和91%的氮?dú)馓幚怼Ｔ谡麄€(gè)手術(shù)和缺氧期間，所有小鼠體溫均維持在37℃[8]。在缺氧的輔助作用下，能形成包括約25%的手術(shù)同側(cè)腦半球面積的梗死。而另外一部分的AD模型采用的是hAPP-SL的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。除了認(rèn)知行為障礙，老年性癡呆患者還大多伴隨精神行為異常，包括焦慮、抑郁、冷漠、妄想和幻覺(jué)[9]。因此，此模型研究者還采用了水平爬梯，Y迷宮和新事物識(shí)別實(shí)驗(yàn)，光(暗)轉(zhuǎn)變測(cè)試來(lái)分別測(cè)試小鼠的運(yùn)動(dòng)，認(rèn)知以及焦慮狀態(tài)。在術(shù)后4周，研究者發(fā)現(xiàn)，缺血都會(huì)加劇年長(zhǎng)hAPP-SL小鼠的以上各種行為缺陷。且與假手術(shù)的hAPP-SL小鼠相比，缺血的hAPP-SL小鼠的丘腦白質(zhì)區(qū)和內(nèi)囊中的磷酸化的tau蛋白也顯著增多。但是，與對(duì)側(cè)半球相比，同側(cè)腦區(qū)的磷酸化的tau蛋白的面積無(wú)差異，表明MCAO損傷以全腦損傷的模式加劇了缺血對(duì)hAPP-SL小鼠中與AD相關(guān)的病理學(xué)。另外，研究人員在手術(shù)后12周對(duì)同側(cè)腦區(qū)勻漿中的Aβ42進(jìn)行了定量檢測(cè)。與假手術(shù)組相比，MCAO組的同側(cè)皮質(zhì)白質(zhì)（包括丘腦和內(nèi)囊）中可溶性Aβ42的水平明顯更高。因此，缺血可能通過(guò)增強(qiáng)的tau和Aβ42加劇了hAPP-SL小鼠的神經(jīng)變性。

綜上，不同于傳統(tǒng)的頸內(nèi)線栓法制備的MCAO模型可能造成的高死亡率[10]，該模型的優(yōu)點(diǎn)是較穩(wěn)定，并且術(shù)后小鼠能長(zhǎng)期存活，可以模擬MxD的多個(gè)特征，但缺點(diǎn)是手術(shù)較為復(fù)雜，較為費(fèi)時(shí)。

1.3 局灶性皮質(zhì)下缺血性中風(fēng)-AD模型

ApoE4-TR：5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠是5XFAD[APP K670N/M671L（瑞典）+I716V（佛羅里達(dá)）+V717I（倫敦）家族性阿爾茨海默氏病（FAD）突變]與突變的人早老素1（PSEN1）的雜交體，其中插入了M146L+L286V FAD突變，通過(guò)人載脂蛋白E4（APOE 4）敲入小鼠系[11]。APOE 4是AD的主要遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子，促進(jìn)Aβ生成[12]。在發(fā)生重大AD病理之前，Hayden等[13]在2月齡小鼠左腦半球內(nèi)進(jìn)行皮質(zhì)下白質(zhì)中風(fēng)或假手術(shù)。誘發(fā)中風(fēng)后，在第7、10、15和20周進(jìn)行新事物識(shí)別和24 h恐懼調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)；在5月齡時(shí)測(cè)量腦代謝以及組織病理學(xué)。局灶性皮質(zhì)下缺血性中風(fēng)模型是通過(guò)在左腦前肢運(yùn)動(dòng)皮層下方立體定位注射不可逆eNOS抑制劑-N5-亞氨基乙基-1-鳥(niǎo)氨酸[L-N5-（1-iminoethyl）ornithine，L-NIO]完成[13]。與假手術(shù)組動(dòng)物相比，中風(fēng)的E4-TR：5XFAD小鼠的皮質(zhì)區(qū)域中的淀粉樣斑塊負(fù)擔(dān)顯著減少，認(rèn)知能力得到了改善。且位于皮層下區(qū)域中的激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)復(fù)雜性增加，表明活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和皮質(zhì)神經(jīng)元之間的相互作用可能促進(jìn)了淀粉樣蛋白清除。由于這種皮層下白質(zhì)缺血模型可以在腦白質(zhì)中精確地產(chǎn)生局灶性中風(fēng)損傷，引起局灶性炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致局部軸突和少突膠質(zhì)細(xì)胞的損失[14]。

皮層下缺血性血管性癡呆是血管性癡呆最常見(jiàn)的亞型，其主要的病理表現(xiàn)為腔隙性腦梗死和腦白質(zhì)病變[15]。那么，該模型僅損傷皮層下白質(zhì)軸突，同時(shí)允許研究損傷的皮層下部位對(duì)與之連接的皮層部位神經(jīng)元的影響，可能更符合臨床上的實(shí)際需求。且該模型采用的5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠模型，有較強(qiáng)但暫時(shí)延遲的淀粉樣蛋白積累速率。使用這種范式，可以研究在hApoE4-TR：5XFAD小鼠發(fā)生嚴(yán)重淀粉樣變性之前，皮層下白質(zhì)缺血性癡呆的引入如何改變淀粉樣病變的產(chǎn)生、皮質(zhì)炎癥、運(yùn)動(dòng)恢復(fù)和認(rèn)知障礙。

2 高血壓-AD模型

根據(jù)流行病學(xué)研究顯示，MxD的主要血管危險(xiǎn)因素是年齡、高血壓、高同型半胱氨酸血癥，以及白質(zhì)高信號(hào)[16-17]。為了探索AD與慢性高血壓之間的協(xié)同作用，Denver等[18]開(kāi)發(fā)了高血壓-AD大鼠模型，該模型是通過(guò)將APPswe/PS1ΔE9轉(zhuǎn)基因小鼠與易發(fā)中風(fēng)的高血壓大鼠（stroke-prone spontaneously hypertensive，SHRSP）雜交產(chǎn)生的。首先，通過(guò)對(duì)血壓的監(jiān)測(cè)，表明高血壓傾向是保留在SHRSP/AD交叉中。然后對(duì)組織的血管神經(jīng)，炎癥和AD病理進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，SHRSP增加了AD依賴性神經(jīng)炎癥，表現(xiàn)為小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活和tau病理增多，但斑塊病理變化卻出人意料，表現(xiàn)為更少的斑塊和緊實(shí)的核斑，表明斑塊負(fù)擔(dān)減輕。血管病理學(xué)證據(jù)包括星形細(xì)胞尾足蛋白aquaporin-4分布異常，正常情況下分布在微血管中，但在SHRSP/AD大鼠中，aquaporin-4大部分與血管分離，表現(xiàn)為無(wú)組織或重新分布于神經(jīng)纖維中。腦小血管樣疾病病理的其他證據(jù)包括腦血管膠原Ⅳ染色增加和血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1水平升高。胱天蛋白酶切割的肌動(dòng)蛋白增加，髓磷脂的損失和神經(jīng)元中鈣結(jié)合蛋白染色的減少。此外，SHRSP/AD存在線粒體缺陷，特別是復(fù)合物Ⅱ的喪失，伴隨著AD依賴的線粒體復(fù)合物Ⅰ的喪失，都表明了SHRSP/AD大鼠神經(jīng)元受損。但在新事物識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，只有AD組表現(xiàn)出識(shí)別指數(shù)的下降；且在Y迷宮試驗(yàn)中，也只有AD組表現(xiàn)出進(jìn)入正確臂次數(shù)下降，而SHRSP/AD組盡管進(jìn)入正確臂次數(shù)下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此行為學(xué)數(shù)據(jù)卻表明引入SHRSP表型并不會(huì)加劇FAD大鼠表現(xiàn)出的認(rèn)知缺陷。

綜上，此模型是基于MxD的危險(xiǎn)因素高血壓而做的嘗試，難點(diǎn)在于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的雜交培養(yǎng)。

3 糖尿病-AD模型

盡管潛在的機(jī)制還尚不清楚，但已知中年肥胖癥和2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）可能會(huì)增加AD的風(fēng)險(xiǎn)[19]。以此為契機(jī)，Niedowicz等[20]創(chuàng)建了一個(gè)新穎的小鼠模型，該模型通過(guò)將病態(tài)肥胖和糖尿病 db/db 小鼠與 APPΔNL/ΔNLx PS1P264L/P264L敲入小鼠雜交來(lái)囊括T2DM和AD的特征。雜交后的小鼠（db/AD）保留了親本系的許多病理特征，如極端肥胖、糖尿病和Aβ的沉積。兩種疾病的結(jié)合也導(dǎo)致了其他病理，其中最引人注目的是嚴(yán)重的腦血管病理，包括動(dòng)脈瘤和中風(fēng)。盡管早老素的總體表達(dá)升高，但糖尿病小鼠的皮質(zhì)部位Aβ沉積并未顯著增加。令人驚訝的是，Aβ沒(méi)有沉積在脈管系統(tǒng)中，也沒(méi)有移至血漿中，并且沒(méi)有刺激主要Aβ清除酶（中性溶酶，胰島素降解酶或內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶）的活化或表達(dá)。與db/db或APPΔNLx PS1P264L小鼠相比，db/AD小鼠在Morris水迷宮中顯示出更明顯的認(rèn)知功能障礙。研究者認(rèn)為這些小鼠的糖尿病和（或）肥胖癥會(huì)導(dǎo)致脈管系統(tǒng)不穩(wěn)定，導(dǎo)致中風(fēng)，進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的認(rèn)知障礙，且這些變化不是直接影響Aβ沉積導(dǎo)致的。

與高血壓-AD模型相似，這種MxD模型基于另一高危因素糖尿病。為研究與肥胖相關(guān)的癡呆風(fēng)險(xiǎn)的潛在機(jī)制提供了新途徑。同樣雙雜交動(dòng)物對(duì)研究成本的要求上提出更高要求。

4 討論

AD和VaD占癡呆癥診斷的80%以上。尸檢時(shí)，約有50%的癡呆患者表現(xiàn)出混合病理特征，即慢性腦血管疾病和AD病理的特征[21]。VaD最常見(jiàn)的神經(jīng)病理特征是皮層下白質(zhì)中的局灶性微血管缺血性中風(fēng)病灶，與AD相似，這些病灶隨時(shí)間累積，是進(jìn)行性損傷的[22]。因此，AD與VaD這些與年齡相關(guān)的損傷具有共同的性質(zhì)，為了理解這兩種病理在神經(jīng)生物學(xué)水平上如何相互作用，關(guān)鍵是使用能夠準(zhǔn)確反映最常觀察到的病理學(xué)的方法進(jìn)行充分建模。

MxD基于各種的模型研究，漸漸提出了幾種假說(shuō)來(lái)建立腦血管病理學(xué)和AD之間的聯(lián)系，包括由白質(zhì)損傷引起的輕度慢性炎癥，導(dǎo)致腦血管清除Aβ的能力受損[23]，以及由APP觸發(fā)的軸突分子死亡途徑[24]，最終導(dǎo)致認(rèn)知功能損傷。眾所周知，心血管疾病增加了AD和MxD的風(fēng)險(xiǎn)，但是如何影響癡呆進(jìn)展仍然難以捉摸。如在局灶性皮質(zhì)下缺血性中風(fēng)-AD模型中，皮質(zhì)下白質(zhì)中風(fēng)反而減少了皮層病灶的淀粉樣斑塊積聚。而在高血壓-AD模型中，行為學(xué)數(shù)據(jù)卻表明引入腦血管病并不會(huì)加劇AD大鼠的認(rèn)知缺陷。且也有研究發(fā)現(xiàn)，具有AD病理特征和腦血管病理特征的受試者損傷較少，認(rèn)知功能下降較慢[25]，以上研究使這些協(xié)同損傷作用必然加重認(rèn)知損傷的簡(jiǎn)單解釋變得尤為復(fù)雜。這些看似自相矛盾的結(jié)果表明，混合病理必然導(dǎo)致淀粉樣蛋白生成加速，進(jìn)而導(dǎo)致癡呆的普遍假設(shè)可能并不完全正確，值得在動(dòng)物模型中進(jìn)行更多研究。