傅振遠， 孟憲芳

華中科技大學同濟醫(yī)學院基礎醫(yī)學院神經(jīng)生物學系，武漢 430030

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可通過調(diào)控基因表達在細胞增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。microRNA-99a(miR-99a)為miRNA家族一員，研究表明，miR-99a在多種惡性腫瘤中調(diào)節(jié)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的信號傳導通路，這提示miR-99a在某些惡性腫瘤中發(fā)揮了關鍵作用?，F(xiàn)就miR-99a在惡性腫瘤中作用機制的相關研究進展文獻綜述如下，以展望miR-99a對于惡性腫瘤的診斷、治療以及預后的應用前景。

1 微小RNA簡介

1.1 研究歷史

第1個被發(fā)現(xiàn)的miRNA是lin-4，研究表明抑制lin-4基因可以影響秀麗隱桿線蟲幼蟲的發(fā)育。但lin-4基因編碼的RNA并不編碼蛋白質(zhì)，而是產(chǎn)生短片段的非編碼RNA。2000年研究者發(fā)現(xiàn)了第2個miRNA：let-7。let-7可以通過抑制lin-41與lin-28[1]基因來促進秀麗隱桿線蟲的發(fā)育轉(zhuǎn)變。隨后，研究表明lin-4和let-7是多物種共有的一類小分子RNA。因后來發(fā)現(xiàn)的許多小分子RNA與lin-4和let-7 RNA有很多相似之處，于是研究人員開始使用術語“microRNA”來指代這類具有調(diào)節(jié)功能的小分子RNA。

近年來關于miRNA的研究揭示了miRNA表達具有細胞特異性與組織特異性，以及miRNA在多種生物發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用，并且miRNA表達水平異常與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系，如惡性腫瘤與心血管疾病。

1.2 結(jié)構(gòu)與功能

miRNA是一種在真核生物中廣泛存在的RNA分子，長約20至24個核苷酸，屬于非編碼RNA。miRNA由DNA先轉(zhuǎn)錄為pri-miRNA(primary miRNA)，進而轉(zhuǎn)變?yōu)閜re-miRNA(即miRNA前體)，最后成為具有功能的成熟miRNA。pri-miRNA的長度大約為300～1000 nt，經(jīng)過加工后成為pre-miRNA，長度大約為70～90 nt，具有特征性的莖環(huán)結(jié)構(gòu)；pre-miRNA出核后經(jīng)過Dicer酶剪切，成為長約20～24 nt的成熟miRNA。

成熟miRNA與Dicer酶及其他蛋白組成RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，其中miRNA通過3′UTR與靶分子結(jié)合，發(fā)揮識別作用。RNA的沉默功能由RISC介導，其中發(fā)揮主要作用的催化亞基是Argonaute蛋白(AGO)。miRNA與AGO結(jié)合后，一條鏈被降解，稱為乘客鏈(passenger strand)；另一條鏈與AGO組裝在一起，發(fā)揮識別功能，稱為引導鏈(guide strand)[2]。RISC對蛋白質(zhì)翻譯過程的抑制作用有多種機制：①在起始過程中，阻止起始復合物的組裝或抑制40S核糖體亞基的募集；②抑制核糖體的組裝；③中斷翻譯進程；④直接降解mRNA等。RISC通過抑制轉(zhuǎn)錄后基因表達，在調(diào)控基因表達、細胞周期、生物發(fā)育等方面起著重要作用(圖1)。

圖1 miRNA的生物合成與作用機制Fig.1 The biological synthesis and mechanism of miRNA

2 miR-99a與腫瘤

大量研究表明，miRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展關系密切[3]，按作用效應可分為致癌型(如miR-21)和抑癌型(如miR-34)。miR-99a是miRNA家族的一員，其編碼基因位于21q21.1。目前已有基于TCGA等數(shù)據(jù)庫的研究證實，miR-99a參與肺癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌與白血病等惡性腫瘤的發(fā)生及進展，可作為判斷預后的重要指標。通過一些外源性方法提高miR-99a在惡性腫瘤中的表達可改變腫瘤的增殖、遷移和侵襲等過程，提示miR-99a對惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要調(diào)節(jié)作用。

2.1 miR-99a與肺癌

肺癌是一種起源于呼吸上皮細胞的惡性腫瘤，其中大多數(shù)是原發(fā)性肺癌。肺癌主要有2種類型：小細胞肺癌和非小細胞肺癌，而非小細胞肺癌又包括肺腺癌與肺鱗癌等類型。肺癌是男性中致死率最高的癌癥，也是導致女性死亡的第2大常見癌癥(僅次于乳腺癌)。肺癌的發(fā)病機制尚不明確，故缺乏有效的對因治療方法。

Maemura等[4]分析了74例肺腺癌標本和相應正常樣本的miRNA表達數(shù)據(jù)，結(jié)果表明與正常對照相比，miR-99a表達下調(diào)。對于miR-99a表達下調(diào)機制有多種解釋，均與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)有一定關系。

研究表明，經(jīng)歷EMT的癌細胞可獲得某些干細胞樣特性，即產(chǎn)生癌癥干細胞(cancer stem cell，CSC)。CSC可以通過增殖和分化產(chǎn)生異質(zhì)性癌細胞，促進腫瘤進展。但EMT的詳細機制目前尚未闡明。一種觀點認為：miR-99a通過直接結(jié)合靶RNA分子的3′-UTR下調(diào)E2F2(E2F transcription factor 2)和EMR2(EGF-like module-containing，mucin-like，hormone receptor-like 2)表達量，導致細胞周期停滯與細胞凋亡，從而抑制上皮細胞的EMT過程；同時也降低了CSC的數(shù)量，并抑制CSC的干細胞特征與惡性程度[5]。另一種解釋認為，miR-99a通過抑制胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)表達來抑制EMT過程[6]。由于過表達miR-99a下調(diào)IGF-1R和通過siRNA降低IGF-1R表達對腫瘤細胞表型產(chǎn)生了相似的影響(如抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲)，表明miR-99a的抑癌作用與IGF-1R有關。

另有研究表明，miR-99a通過靶向NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)介導的ROS生成通路來抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移[7]。在腫瘤轉(zhuǎn)移前，NOX4表達量增加可加速肺癌病程進展。其機制可能為NOX4通過正反饋調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路來促進非小細胞肺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移，而PI3K/AKT信號通路也可通過NF-κB信號通路來正調(diào)控NOX4表達量[8]。其他研究發(fā)現(xiàn)，恢復AKT1正常表達可部分消除miR-99a對非小細胞肺癌細胞侵襲的抑制作用，表明miR-99a介導的腫瘤抑制作用與調(diào)節(jié)AKT1表達有關[9]。

2.2 miR-99a與膀胱癌

膀胱癌是一種發(fā)生于膀胱組織中的惡性腫瘤，是我國目前發(fā)病率最高的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤(歐美則為前列腺癌)。膀胱癌最常見的病理類型是移行細胞癌，其他類型則包括鱗狀細胞癌和腺癌等。引起膀胱癌的危險因素眾多，但具體發(fā)病機制尚不明確，故目前治療仍以手術為主。

Li等[10]通過分析GEO和TCGA等數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)miR-99a的表達水平在膀胱癌中低于正常對照。在膀胱癌組織中PI3K/AKT/mTOR信號通路通常呈激活狀態(tài)，目前作為膀胱癌治療的潛在靶點[11]。另有研究通過生物信息學分析證實膀胱癌組織中多種異常表達的miRNA與PI3K信號通路、胰島素/IGF信號通路和FGF信號通路均密切相關[12]，故miR-99a在膀胱癌診斷與治療中有重要的應用價值。

現(xiàn)有研究證實，miR-99a通過靶向膀胱癌細胞膜上的生長因子受體3(fibroblast growth factor receptor 3，F(xiàn)GFR3)與mTOR(mammalian target of rapamycin)來抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲。熒光素酶測定結(jié)果表明，在miR-99a-5p轉(zhuǎn)染的細胞中miR-99a-5p直接結(jié)合至mTOR的3′-UTR，抑制mTOR mRNA和蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達，并且過表達miR-99a-5p可通過靶向mTOR核心蛋白進而對mTORC1和mTORC2產(chǎn)生雙重抑制作用[13]。另有研究通過向膀胱癌細胞系中轉(zhuǎn)染miRNA-99a后，測定了細胞活性、細胞遷移相關指標，證實miR-99a可通過靶向膀胱癌細胞表面的FGFR3來抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲[14]，這些結(jié)果表明miRNA-99a可以通過調(diào)節(jié)mTOR與FGFR3來調(diào)控膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。

2.3 miR-99a與乳腺癌

乳腺癌是一種發(fā)生于乳腺組織中的惡性腫瘤，是女性最常見的惡性腫瘤之一。乳腺癌有2種常見類型：起源于導管上皮細胞的惡性腫瘤被稱為導管癌；起源于乳腺小葉細胞的惡性腫瘤被稱為小葉癌。乳腺癌的病因目前尚不清楚，可能與雌激素水平、環(huán)境因素與生活方式等有關。

Adhami等[15]比較了乳腺癌和正常組織之間的miRNA表達水平差異，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中miR-99a表達水平低于正常對照。Hu等[16]測定了多種乳腺癌細胞系與10名乳腺癌患者腫瘤標本中miR-99a的表達水平，也發(fā)現(xiàn)miR-99a表達水平顯著下調(diào)。通過進一步研究，他們認為作用機制可能是miR-99a表達水平下調(diào)升高了mTOR及其下游磷酸化蛋白(包括p-4E-BP1和p-S6K1)的表達量，因為恢復miR-99a正常表達可抑制mTOR信號通路及其下游磷酸化蛋白表達。

另有研究認為IGF-1R與HOXA1(homeobox A1)mRNA是miR-99a作用的直接靶標。Wang等[17]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中HOXA1的表達量顯著升高，同時敲除HOXA1可顯著抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，故HOXA1可能是一個受到miRNA抑制的癌基因。進一步研究證實miR-99a可直接與HOXA1 mRNA的3′UTR結(jié)合，而且恢復HOXA1表達可部分逆轉(zhuǎn)miR-99a對乳腺癌細胞的抑制作用，這些結(jié)果表明HOXA1是miR-99a的直接作用靶點。與之類似，Xia等[18]發(fā)現(xiàn)通過siRNA降低內(nèi)源性IGF-1R表達可產(chǎn)生與過表達miR-99a相似的作用，從而證實IGF-1R是miR-99a在乳腺癌中的作用靶點。

2.4 miR-99a與肝癌

肝癌是發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，其中最常見的類型是肝細胞癌。造成肝癌的主要病因為乙型肝炎、丙型肝炎或醇類物質(zhì)所導致的肝硬化。其他病因則包括黃曲霉素、非酒精性脂肪肝和肝吸蟲等。我國肝癌患者最常見的病因是乙型肝炎病毒感染，而在歐美等發(fā)達地區(qū)醇類物質(zhì)所導致的肝硬化與丙型肝炎病毒感染是更為常見的病因[19]。然而這些病因?qū)е赂伟┌l(fā)生的具體機制目前仍未研究透徹。

Li等[20]通過對Illumina Solexa測序進行分析，發(fā)現(xiàn)miR-99a的表達水平在肝癌中低于相應的正常對照。由于miR-99a表達水平的降低程度與肝癌患者的生存率呈負相關，故miR-99a可作為肝癌患者預后的評價指標。Li等同時發(fā)現(xiàn)在體外恢復miR-99a正常表達可顯著抑制肝癌細胞的生長繁殖，而且瘤內(nèi)注射miR-99a mimics可抑制腫瘤生長并降低攜帶肝癌的裸鼠體內(nèi)甲胎蛋白水平。通過進一步研究，他們認為可能的機制是miR-99a可誘導肝癌細胞產(chǎn)生G1期停滯。

最近大量研究表明PI3K/AKT/mTOR信號通路及其下游的轉(zhuǎn)錄因子是新型肝癌標志物[21]。Li等[20]發(fā)現(xiàn)肝癌組織中的miR-99a表達量與IGF-1R和mTOR的表達水平呈負相關。進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-99a mimics可抑制IGF-1R和mTOR信號通路，進而抑制細胞周期相關蛋白的表達，如細胞周期蛋白D1。這可能是miR-99a對肝癌抑制作用的機制之一。另有研究發(fā)現(xiàn)在體外應用IGF-1(IGF-1R的配體)或MHY1485(mTOR激動劑)可逆轉(zhuǎn)miR-99a抑制腫瘤生長的作用，表明IGF-1R和mTOR是miR-99a在肝癌中的直接靶標[22]。

2.5 miR-99a與白血病

白血病是一類骨髓造血干細胞異常增殖并產(chǎn)生大量異常白細胞的惡性克隆性疾病，是兒童中最常見的惡性腫瘤。這些尚未分化成熟的白細胞被稱為白血病細胞。白血病主要有4種類型：急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、急性髓性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)、慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)和慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)。白血病的病因尚不清楚，可能與感染、接觸某些物理或化學因素有關。

Cheng等[23]分析了74名AML患者的miR-99a表達報告，發(fā)現(xiàn)在AML與CML中miR-99a表達水平增高與不良預后顯著相關。進一步對其機制進行研究發(fā)現(xiàn)miR-99a可以靶向兩種抑癌基因：CTDSPL(CTD small phosphatase like)和TRIB2(tribbles pseudokinase 2)[24]，故miR-99a表達水平上調(diào)可加速AML與CML的進展。

與AML和CML相反，miR-99a表達在多數(shù)ALL患者中呈抑制狀態(tài)[25]。作用機制可能為miR-99a可抑制FKBP51(FK506-binding protein 51)表達，而FKBP51可抑制白血病細胞凋亡，是腫瘤靶向治療的潛在靶點。ALL患者中miR-99a表達下調(diào)導致FKBP51表達水平升高，可進一步抑制糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)的活性。故在ALL細胞中恢復miR-100和miR-99a表達水平可抑制白血病細胞增殖并增加地塞米松誘導的細胞凋亡。另一種作用機制可能為miR-99a過表達可抑制IGF-1R/mTOR信號通路及其下游癌基因Mcl-1表達，故表現(xiàn)出抑癌作用。Mcl-1是Bcl-2蛋白家族中的一種癌基因，在許多癌癥中高度擴增，可導致腫瘤細胞異常增殖和細胞凋亡逃逸，也是白血病靶向治療的潛在靶點。

白血病細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥是白血病治療的一大難題，研究發(fā)現(xiàn)miR-99a異常表達可上調(diào)下游靶基因(如E2F和Myc)和部分在白血病干細胞(Leukemia stem cell，LSC)細胞周期中發(fā)揮重要作用的基因的表達，導致白血病細胞暴露于化療藥物后，集落形成能力和增殖能力增強，還有部分原因是由于miR-99a表達水平升高可導致白血病細胞對化療藥物誘導的細胞周期停滯產(chǎn)生抵抗(如長春新堿和柔紅霉素[26-27])。同時該研究表明，miR-99a可作為監(jiān)測白血病病程進展的生物標志物[28]。

2.6 其他癌癥

已有多篇文獻報道m(xù)iR-99a在人類惡性腫瘤中呈現(xiàn)低水平表達，如前列腺癌、口腔鱗癌、頭頸部鱗癌、食管鱗狀細胞癌、宮頸癌、卵巢癌、Kaposi肉瘤等惡性腫瘤[29-33]。這意味著miR-99a是一個潛在的腫瘤抑制因子。然而，miR-99a并非在所有惡性腫瘤中都呈現(xiàn)低表達水平，有研究顯示miR-99a可能在某些惡性腫瘤中(如胃癌、腎癌、結(jié)腸癌)表達水平升高，起著致癌因子的作用[34-37]。miR-99a在惡性腫瘤中的作用機制研究進展匯總見圖2。

圖2 miR-99a在惡性腫瘤中作用機制的研究進展Fig.2 The research progress of the action mechanism of miR-99a in malignant tumor

3 展望

miR-99a與肺癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌和白血病等癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關，其異常表達提示miR-99a是多種惡性腫瘤的潛在治療靶點，并且在惡性腫瘤的早期診斷、腫瘤分期分級與預后判斷等方面也有一定的價值。然而，miR-99a及其相關信號通路在惡性腫瘤中的作用機制尚未完全明確，進一步研究其作用機制對miR-99a成為惡性腫瘤治療的新靶點具有重要的意義。