胡仁旺， 龔建平

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院胃腸外科，武漢 430030

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，治療方式以手術切除為主。近年來的研究發(fā)現(xiàn)胃癌的預后不僅與病理分期有關，還與腫瘤微環(huán)境具有明顯的相關性[1-3]。腫瘤微環(huán)境主要包括腫瘤細胞、基質(zhì)細胞和免疫細胞等。越來越多的文獻證實免疫細胞的浸潤是影響胃癌預后的重要因素，因此篩選影響胃癌預后的免疫相關基因具有重要意義[4]。TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫包含各種腫瘤完整的臨床信息和基因測序信息[5-6]，且其數(shù)據(jù)信息及患者隨訪信息處于不斷更新狀態(tài)。ImmPort(The Immunology Database and Analysis Portal)數(shù)據(jù)庫[7-8]是最常用的免疫相關基因數(shù)據(jù)庫之一，其中包含大量已經(jīng)鑒別出來的免疫相關基因，因此可以通過R軟件將TCGA數(shù)據(jù)庫和ImmPort數(shù)據(jù)庫結(jié)合起來篩選出影響胃癌術后總體生存率的免疫相關基因。本研究將篩選出來的免疫相關基因與免疫細胞、基質(zhì)細胞及腫瘤純度等腫瘤微環(huán)境的相關指標進行相關性分析，探討其影響腫瘤預后的機制，并通過生物富集分析了解基因的相關表達通路，以此深入了解胃癌免疫相關基因的功能，以期更好地指導臨床工作。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

通過TCGA數(shù)據(jù)庫下載胃癌患者的臨床信息和基因表達信息，將臨床信息和基因表達信息合并，刪除缺失值。通過ImmPort免疫數(shù)據(jù)庫獲取免疫相關基因列表，并提取對應的免疫相關基因在胃癌患者中的表達量。

1.2 研究流程

首先利用數(shù)據(jù)庫信息篩選出胃癌患者的癌旁組織和腫瘤組織之間具有統(tǒng)計學意義的差異表達基因，且差異表達在2倍以上。然后利用Kaplan-Meier法在差異表達基因中篩選出影響胃癌患者預后的基因,并與通過單因素COX回歸分析篩選出來的臨床指標進行合并，再進行多因素COX回歸分析，篩選出獨立預后的風險基因。對篩選出來的風險基因進行與臨床病理、免疫細胞浸潤、腫瘤微環(huán)境的相關性分析和基因信號通路富集分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有統(tǒng)計計算均通過R軟件完成，生存分析采用Kaplan-Meier法，2個指標之間的比較采用Wilcox檢驗法(如腫瘤組織和癌旁組織之間基因表達量的比較)，3個及以上指標之間的比較采用Kruskal-Wallis檢驗法(如單個基因在腫瘤不同T分期患者之間的比較)，臨床相關性分析采用Spearman相關分析法。圖形繪制均用R軟件完成，均以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 納入病例的臨床資料及篩選出的基因信息

通過數(shù)據(jù)整理及基因與臨床信息的合并，刪除缺失值后，最終納入患者313例，其中男性198例，女性115例。Grade分級：Ⅰ級7例，Ⅱ級108例，Ⅲ級198例。T分期：T1期15例，T2期64例，T3期151例，T4期83例。M分期：M0期292例，M1期21例。N分期：N0期94例，N1期86例，N2期69例，N3期64例。篩選出胃癌腫瘤組織和癌旁組織之間差異表達的免疫相關基因345個，其中對胃癌術后總體生存率有影響的基因有20個(CGB5、INHBB、TMSB15A、DKK1、GDF7、SLC22A17、GHR、MMP12、PGF、FGFR4、IGHV3-35、INHBA、IGHD3-16、IGLV3-22、MASP1、BMP8A、CARD11、NOX4、NPR3、IGHA1)。

2.2 臨床指標的單因素COX回歸分析

如圖1所示，通過對臨床指標進行單因素COX回歸分析發(fā)現(xiàn)：年齡[HR=1.020，95%CI：1.003～1.037，P=0.019]、T分期[HR=1.369，95%CI：1.102～1.702，P=0.005]、M分期[HR=2.502，95%CI：1.435～4.365，P=0.001]和N分期[HR=1.349，95%CI：1.155～1.575，P<0.01]為影響胃癌預后的風險因素。

圖1 臨床指標單因素COX回歸分析Fig.1 Univariate COX regression analysis of clinical indexes

2.3 多因素COX回歸分析

將影響患者預后的臨床指標(年齡、T分期、M分期、N分期)與影響患者術后生存率的20個免疫相關基因合并進行多因素COX回歸分析。如圖2所示：臨床指標中，年齡[HR=1.054，95%CI：1.030～1.078，P<0.01]、M分期[HR=2.596，95%CI：1.217～5.537，P=0.014]和N分期[HR=1.276，95%CI：1.050～1.551，P=0.014]為影響胃癌術后的獨立風險因素。在基因指標中：NOX4基因[HR=3.008，95%CI：1.706～5.306，P<0.01]、SLC22A17基因[HR=1.087，95%CI：1.024～1.154，P=0.007]和DKK1基因[HR=1.003，95%CI：1.000～1.007，P=0.039]為影響胃癌預后的獨立風險因素，且這3個基因的表達量越高，患者預后越差。

圖2 多因素COX回歸分析Fig.2 Multivariate COX regression analysis

2.4 預后免疫相關基因?qū)颊呖傮w生存率的影響

如圖3所示：高表達NOX4基因(χ2= 4.2，P=0.041)、SLC22A17基因(χ2= 6.6，P=0.010)、DKK1基因(χ2= 7.4，P=0.007)患者的術后總體生存率明顯低于低表達組患者，差異均有統(tǒng)計學意義。

圖3 預后免疫相關基因生存曲線Fig.3 Survival curves of prognostic immune-related genes

2.5 預后免疫相關基因表達量分析

如圖4所示：在腫瘤組織中NOX4基因、DKK1基因表達量明顯高于正常組織(均P<0.05)，而SLC22A1基因在腫瘤組織中表達量的中位值低于正常組織(P<0.01)。

2.6 預后免疫相關基因與臨床病理指標的相關性分析

通過R軟件，采用Kruskal-Wallis檢驗方法對病理分級和病理分期(T、N、M)進行檢驗。NOX4、SLC22A17、DKK1基因的表達在N分期和M分期中均無統(tǒng)計學差異，因此未繪制圖形。如圖5所示：在T分期中，隨著T分期的進展NOX4基因和SLC22A17基因表達量有逐漸增高趨勢，而DKK1基因在T2和T3期的基因表達量相對較高，差異均具有統(tǒng)計學意義。在病理分級中，NOX4基因和SLC22A17基因在不同病理分級中表達不同，但沒有明顯的上升趨勢，DKK1基因表達在各病理分級中的差異無統(tǒng)計學意義。

圖4 預后免疫相關基因在正常組織和腫瘤組織的表達量Fig.4 Expression of prognostic immune-related genes in normal and tumor tissues

圖5 預后免疫相關基因與臨床病理指標相關性分析Fig.5 Analysis of the correlation between prognostic immune-related genes and clinicopathological indexes

2.7 預后免疫相關基因與免疫細胞浸潤量的相關性分析

通過TIMER免疫細胞數(shù)據(jù)庫[9-10]探索NOX4、SLC22A17及DKK1基因與免疫細胞浸潤量的相關性，相關性分析采用Spearman相關分析法。如表1所示：NOX4基因表達與B細胞浸潤量、CD8+T細胞浸潤量、CD4+T細胞浸潤量、巨噬細胞浸潤量、中性粒細胞浸潤量和樹突狀細胞浸潤量之間均具有明顯相關性，差異均具有統(tǒng)計學意義。SLC22A17基因表達量與B細胞浸潤量、CD8+T細胞浸潤量、CD4+T細胞浸潤量、巨噬細胞浸潤量、中性粒細胞浸潤量和樹突狀細胞浸潤量之間均具有明顯相關性，差異均具有統(tǒng)計學意義。DKK1基因表達量與CD8+T細胞浸潤量和巨噬細胞浸潤量之間具有明顯相關性，差異均具有統(tǒng)計學意義。

表1 預后免疫相關基因與免疫細胞浸潤量的相關性分析Table 1 Analysis of the relationship between prognostic immune-related genes and immune cell infiltration

2.8 預后免疫相關基因與腫瘤微環(huán)境相關性分析

基質(zhì)細胞和免疫細胞是構成腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，通過R語言“estimate”包采用“ESTIMATE”免疫評分算法[11]對基質(zhì)細胞和免疫細胞進行評分，并計算其與NOX4、SLC22A17及DKK1基因表達的相關性，相關性方法也采用Spearman相關系數(shù)法。如表2所示：NOX4基因表達量與基質(zhì)細胞評分、免疫細胞評分及總評分之間均呈正相關(P<0.01)。SLC22A17基因與基質(zhì)細胞評分、免疫細胞評分及總評分之間也均呈正相關(P<0.01)。而DKK1基因表達與腫瘤微環(huán)境的基質(zhì)細胞及免疫細胞均無相關關系。

表2 預后免疫相關基因與腫瘤微環(huán)境相關性分析Table 2 Analysis of the relationship between prognostic immune-related genes and tumor microenvironment

2.9 免疫相關基因的通路富集分析

通過R軟件“org.Hs.eg.db”包對影響胃癌術后總體生存率的20個基因進行GO(Gene Ontology)通路富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。將20個基因全部納入后，富集分析分析的通路相對更為準確且同時可以縮小尋找NOX4、SLC22A17及DKK1基因通路的研究范圍。通過GO富集分析(BP、CC、MF分別代表生物過程、細胞組成、分子功能3種富集分析方法)發(fā)現(xiàn)346條有統(tǒng)計學意義的基因通路；通過KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)7條有統(tǒng)計學意義的基因通路。篩選各種富集分析方法中有意義的前10條基因通路繪制圖6。從圖中可知與預后相關的免疫相關基因可能與細胞因子生物合成過程的調(diào)控(regulation of cytokine biosynthetic process)、細胞因子代謝過程(cytokine metabolic process)和細胞因子受體間相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)等基因通路具有一定相關性。

圖6 GO、KEGG基因通路富集分析Fig.6 Gene pathway enrichment analysis by GO and KEGG

3 討論

免疫相關基因是指通過研究鑒別出來的與免疫反應個別通路或部分通路明顯相關的基因。本研究通過Kaplan-Meier法篩選出來的20個與免疫相關的基因，均影響胃癌患者的術后總體生存率，通過GO和KEGG生物富集分析，我們也發(fā)現(xiàn)這些影響腫瘤預后的基因表達量與多條細胞因子通路和免疫突觸具有明顯的相關性。通過多因素COX回歸分析，我們篩選出3個影響胃癌預后的獨立風險基因：NOX4、SLC22A17和DKK1基因。其中NOX4基因(NADPH Oxidase 4，NADPH氧化酶4)有研究表明其可依賴脂肪酸氧化促進巨噬細胞NLRP3炎癥小體激活[12]。在胃癌中通過RNAi介導的NOX4沉默調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號通路可抑制胃癌細胞的侵襲[13]，也可誘導通過GLI1途徑調(diào)節(jié)胃癌細胞的增殖和凋亡[14]。在通過GO法富集到的346條有統(tǒng)計學意義的基因通路中，與NOX4基因相關的有45條，其中還與DNA生物合成的調(diào)控(positive regulation of DNA biosynthetic process)、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)控(positive regulation of protein serine/threonine kinase activity)等信號通路明顯相關。目前關于SLC22A17基因(solute carrier family 22 member 17，溶質(zhì)載體家族蛋白22成員17)在胃癌中的研究尚未見文獻報道，但有文獻表明，SLC22A17基因與脂鈣蛋白2(lipocalin2，Lcn2)基因協(xié)同參與子宮內(nèi)膜癌細胞的侵襲過程[15]。通過上文分析我們發(fā)現(xiàn)SLC22A17基因在腫瘤組織中表達量的中位值低于正常組織(P<0.01)。這在基因與腫瘤預后的研究中也是非常常見的現(xiàn)象，因為SLC22A17基因為蛋白編碼基因，mRNA基因高表達并不代表著蛋白水平高表達，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程是一個非常復雜的生物學過程，對于促癌基因在腫瘤中的基因表達水平也可能低于正常組織。通過富集分析我們發(fā)現(xiàn)SLC22A17基因與輔因子輸運(cofactor transport)通路具有明顯的相關性。而對于DKK1基因(dickkopf Wnt signaling pathway inhibitor 1，Dickkopf-Wnt信號通路抑制劑1)，單純從基因的命名上來看我們就知道DKK1基因與Wnt信號通路具有明顯的相關性，通過富集分析，我們發(fā)現(xiàn)與DKK1基因表達具有明顯相關的信號通路有100條，而與Wnt信號通路有相關性的有4條，分別為：非典型Wnt信號通路的正調(diào)控(positive regulation of non-canonical Wnt signaling pathway)、Wnt信號通路與細胞極性通路(regulation of Wnt signaling pathway，planar cell polarity pathway)、非典型Wnt信號通路的調(diào)控(regulation of non-canonical Wnt signaling pathway)、Wnt信號通路與鈣調(diào)節(jié)通路(Wnt signaling pathway，calcium modulating pathway)。通過檢索文獻我們發(fā)現(xiàn)DKK1基因與MIR-493基因相互作用，共同調(diào)控胃癌細胞的侵襲[16]。也有文獻表明DKK1基因受啟動子甲基化的調(diào)控，影響膽汁酸誘導的胃黏膜腸化生[17]。因此，基于DKK1基因的免疫調(diào)控作用，有學者研究證明，抗DKK1的抗體DKN-01可以作為免疫調(diào)節(jié)劑用于腫瘤的治療[18]。

腫瘤免疫治療是近年來研究的熱點[19]，最常見且較易檢測的免疫細胞包括6種：B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀狀細胞。通過TIMER免疫數(shù)據(jù)庫對NOX4、SLC22A17和DKK1基因與免疫細胞浸潤量進行相關性研究，我們發(fā)現(xiàn)NOX4和SLC22A17基因表達量與這6種免疫細胞的相關性均具有統(tǒng)計學意義，DKK1基因表達量與CD8+T細胞、巨噬細胞的浸潤量的相關性具有統(tǒng)計學意義，這也再次說明了篩選出來的3個獨立預后的免疫相關基因與腫瘤免疫密切相關。同時我們也發(fā)現(xiàn)這3個基因在胃癌患者中均與巨噬細胞的浸潤量具有明顯相關性，這一結(jié)論與很多文獻一致[20-22]。目前很多文獻的研究結(jié)果均表明胃癌患者的預后與巨噬細胞的浸潤量明顯相關。

胃癌患者的術后總體生存率是由多項臨床指標和基因表達共同影響的[23]，近年來越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境也是影響腫瘤預后的關鍵因素[24]。通常腫瘤微環(huán)境由腫瘤細胞、基質(zhì)細胞[25]、免疫細胞及各種細胞因子[26]共同組成，這些組成部分之間相互作用,生物學過程復雜[27]。通常以腫瘤純度評估腫瘤細胞含量的多少，腫瘤純度一般與基質(zhì)細胞和免疫細胞的含量呈負相關關系。通過本研究我們也發(fā)現(xiàn)NOX4基因和SLC22A17基因與免疫細胞評分、基質(zhì)細胞評分及二者相加的總評分之間均呈正相關(均P<0.01)。因此也說明了NOX4基因和SLC22A17基因?qū)ξ赴┗颊呖傮w生存率的影響，可能也有免疫系統(tǒng)的作用。

總之，本研究使我們加深了對胃癌的免疫相關基因的認識，同時也篩選出了所有影響預后的風險免疫相關基因。通過對免疫細胞、基質(zhì)細胞、基因通路的進一步探索，也為我們的下一步研究明確了方向，對胃癌的免疫治療具有一定的臨床意義。