王海瑞， 原 翔， 劉怡文， 孫 蔚， 王 甄， 常保萍， 高社干

河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南科技大學(xué)腫瘤研究所，河南省腫瘤表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng) 471003

食管癌是最常見的胃腸道腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]，且每年死亡人數(shù)超過(guò)40萬(wàn)[3]。食管癌有兩個(gè)主要的組織學(xué)類型，包括食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)和食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)，食管腺癌是歐美國(guó)家常見的類型，約占70%～80%，但亞洲和非洲國(guó)家以食管鱗癌更為多見，在我國(guó)，90%左右食管癌為鱗癌[4-6]。食管鱗癌患者在早期可能有諸如消瘦、惡心、體重減輕等不明確的癥狀，影響早期診斷準(zhǔn)確性，致使多數(shù)患者就診時(shí)已到晚期或伴有轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差。當(dāng)下，雖然對(duì)食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展和治療等方面的研究已經(jīng)取得了可觀的進(jìn)展，但是依然沒有有效的治療方法，且存活率較低[7]。研究者們長(zhǎng)期致力于尋找影響食管癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的重要因子，以期預(yù)測(cè)其發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的情況。

GNAI2(Guanine nucleotide-binding protein G(i) subunit alpha-2)屬于G蛋白家族中的一個(gè)抑制型，主要作用是抑制腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclase，AC)的活性，降低細(xì)胞內(nèi)第二信使環(huán)磷酸腺苷(cyclic AMP，cAMP)含量，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，是一種極其重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子。已有大量研究顯示，GNAI2在舌鱗狀細(xì)胞癌[8]、卵巢癌[9]、前列腺癌[10-11]、結(jié)直腸癌[12-13]等腫瘤中的表達(dá)與患者的預(yù)后密切相關(guān)。本研究旨在探討食管鱗癌及癌旁組織中GNAI2的表達(dá)情況及其差異，并分析其與食管鱗癌患者臨床病理特征的相關(guān)性，以期為食管鱗癌的治療提供新的思路和靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 病例資料

篩選在河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012年10月到2013年12月期間行手術(shù)切除的食管鱗癌患者，取癌組織及配對(duì)癌旁組織(距腫瘤組織邊緣>5 cm)完整的石蠟包埋標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者術(shù)前均未接受化療、放療及免疫治療；②治療性食管鱗癌切除術(shù)后；③術(shù)后病理明確診斷為食管鱗癌；④病例資料信息全面；⑤中位隨訪時(shí)間為60個(gè)月；⑥癌組織及配對(duì)癌旁組織標(biāo)本完整。通過(guò)分析和篩選，共50例食管鱗癌患者組織標(biāo)本被納為研究對(duì)象，其中，男32例，女18例；年齡<60歲14例，≥60歲36例；高分化18例，中分化25例，低分化7例；浸潤(rùn)深度≥外膜36例，<外膜14例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例；TNM分期Ⅰ/Ⅱ期28例，Ⅲ/Ⅳ期22例。50例食管鱗癌患者術(shù)后隨訪時(shí)間均為60個(gè)月，生存時(shí)間為入院時(shí)間至最后一次隨訪日期或死亡日期，刪失數(shù)據(jù)是指隨訪至60個(gè)月仍存活的患者，未刪失數(shù)據(jù)為由食管鱗癌導(dǎo)致的死亡患者。本研究經(jīng)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤研究所及醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，所有患者在參與研究前均知情同意。

1.2 主要試劑與儀器

鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶(streptavidin peroxidase，SP)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，GNAI2兔抗人單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)，檸檬酸抗原修復(fù)液(pH6.0)、蘇木精、中性樹膠、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)均購(gòu)自北京中杉金橋有限公司，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)食管鱗癌及癌旁組織中GNAI2蛋白表達(dá)

設(shè)定厚度為3 μm，對(duì)選取的石蠟包埋組織標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片；置于60℃烤箱中溶蠟1.5 h，趁熱放入二甲苯溶液中浸泡脫蠟3次，10 min/次，隨后進(jìn)行乙醇梯度水化，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為100%、95%、90%、85%，每次5 min；將片子放入95℃檸檬酸中抗原修復(fù)15 min；PBS沖洗3次，5 min/次；用過(guò)氧化物酶阻斷劑封閉10 min；PBS沖洗，5 min/次，共3次；山羊血清封閉30 min，消除非特異性染色，提高目的蛋白的準(zhǔn)確性、降低背景；切片上滴加50 μL一抗(GNAI2兔抗人單克隆抗體，PBS稀釋比1∶200)，4℃過(guò)夜；PBS沖洗3次，5 min/次；滴加山羊抗鼠/兔二抗覆蓋組織，室溫孵育30 min；PBS沖洗，5 min/次，共3次；滴加SP室溫封閉10 min；PBS沖洗，5 min/次，共3次；DAB顯色10 min；蒸餾水沖洗10 min；蘇木精復(fù)染10 min，乙醇脫水、常規(guī)二甲苯透明，中性樹膠封片；在光學(xué)顯微鏡下觀察食管鱗癌及癌旁組織中GNAI2蛋白的表達(dá)情況。以2名資深病理科醫(yī)生判定的陽(yáng)性切片為陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照為PBS緩沖液替代一抗做出的陰性切片。陽(yáng)性染色判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)淺黃色、棕黃色或棕褐色著色。染色強(qiáng)度計(jì)分：0分(無(wú)色至淺黃色)，1分(棕黃色)，2分(棕褐色)，3分(深褐色)；陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：<5%為0分，≥5%且<25%為1分，≥25%且<50%為2分，≥50%且<75%為3分，≥75%為4分；綜合評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為每個(gè)視野染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分的乘積，0～3分為陰性，4～12分為陽(yáng)性，最終免疫組織化學(xué)評(píng)分為隨機(jī)取5個(gè)視野評(píng)分的均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌及癌旁組織中GNAI2蛋白表達(dá)比較

食管鱗癌及癌旁組織中均可見細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，為GNAI2陽(yáng)性表達(dá)(圖1)。癌組織中GNAI2免疫組織化學(xué)評(píng)分(8.33±1.45)顯著高于癌旁組織[(3.17±0.60)，P<0.05]；分化程度越低的組織，免疫組織化學(xué)評(píng)分越高[圖1A高分化：(7.00±0.58)、圖1B中分化：(8.00±1.22)、圖1C低分化：(11.00±0.58)]。

A：高分化；B：中分化；C：低分化；D：癌旁組織圖1 食管鱗癌組織及癌旁組織中GNAI2的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)Fig.1 Expression of GNAI2 in esophageal squamous cell carcinoma and adjacent tissues(immunohistochemical staining，×400)

2.2 GNAI2表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

結(jié)果見表1。GNAI2蛋白與食管鱗癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤侵襲深度、TNM分期以及5年生存情況具有明顯的相關(guān)性(均P<0.05)，但是與患者的年齡和性別不具有相關(guān)性(均P>0.05)。

2.3 食管鱗癌患者預(yù)后與其臨床病理特征之間的相關(guān)性

COX回歸分析結(jié)果見表2，GNAI2表達(dá)情況及腫瘤分化程度是食管鱗癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素(表2，P<0.05)。

表2 食管鱗癌患者預(yù)后影響因素的Cox回歸分析Table 2 Cox regression analysis of prognostic factors of patients with esophageal squamous cell carcinoma

2.4 GNAI2陽(yáng)性組和陰性組與食管鱗癌5年生存預(yù)后相關(guān)性

結(jié)果見表3、圖2、圖3。50例食管鱗癌患者的術(shù)后5年總生存率為32.00%，中位生存時(shí)間為(33.00±3.03)月。其中GNAI2蛋白表達(dá)陽(yáng)性組5年生存率為18.75%，中位生存時(shí)間為(31.00±2.12)月；GNAI2蛋白表達(dá)陰性組的5年生存率為55.56%；GNAI2蛋白表達(dá)陽(yáng)性組明顯低于GNAI2蛋白表達(dá)陰性組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3，χ2=6.022，P=0.014)。

表3 GNAI2陽(yáng)性組與陰性組食管鱗癌患者生存時(shí)間(月)的均數(shù)和中位數(shù)Table 3 Mean and median survival time(months) of patients with esophageal squamous cell carcinoma in the GNAI2 positive and negative groups

圖2 食管鱗癌患者術(shù)后5年Kaplan-Meier生存曲線Fig.2 Kaplan-meier specific survival curve in patients with esophageal squamous cell carcinoma 5 years after operation

3 討論

近年來(lái)食管鱗癌的發(fā)病率和死亡率不斷呈上升趨勢(shì)。目前雖然對(duì)于食管鱗癌有手術(shù)、化療、放療等治療手段，但是患者預(yù)后仍較差。因此，為改善治療效果，提高患者整體預(yù)后水平，尋找并研究影響食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展的因素，預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)展預(yù)后情況，找到新的分子靶點(diǎn)，在食管鱗癌治療中具有重要臨床意義。

圖3 GNAI2陽(yáng)性組與陰性組食管鱗癌患者術(shù)后5年Kaplan-Meier生存曲線Fig.3 Specific Kaplan-meier survival curves for patients with GNAI2 positive/negative esophageal squamous cell carcinoma 5 years after surgery

G蛋白，即鳥苷酸結(jié)合蛋白，由α、β、γ等3個(gè)亞單位組成異源三聚體，是細(xì)胞內(nèi)一類重要的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白[14]。根據(jù)亞單位的不同，G蛋白有不同的分類，結(jié)構(gòu)上的差別主要表現(xiàn)在α亞單位(Gα)，根據(jù)Gα的DNA序列同源性不同，Gα分為Gi、Gq、Gs、G12等4個(gè)家族。GNAI2屬于Gi類的一個(gè)抑制型。Li等[13]采用組織學(xué)、免疫印跡、免疫組織化學(xué)和RNA測(cè)序分析等手段進(jìn)行的研究表明，與正常組織相比，結(jié)直腸癌患者的結(jié)腸腫瘤組織中GNAI1和GNAI3水平降低，GNAI2水平升高，對(duì)人類結(jié)直腸腫瘤DNA微陣列公共數(shù)據(jù)庫(kù)(GSE39582)的進(jìn)一步分析表明，低GANI1和GNAI3 mRNA表達(dá)以及高GNAI2 mRNA表達(dá)與總生存時(shí)間的減少顯著相關(guān)；Jiang等[8]研究發(fā)現(xiàn)GNAI2在舌鱗狀細(xì)胞癌中異常高表達(dá)，并與舌鱗狀細(xì)胞癌的病理因素相關(guān)，其表達(dá)水平與舌鱗狀細(xì)胞癌患者生存呈負(fù)相關(guān)；陳寧等[10]對(duì)60例前列腺癌和前列腺增生組織中GNAI2蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，癌組織中GNAI2表達(dá)高于前列腺增生組織，且臨床分期越晚其表達(dá)量越高，提示GNAI2對(duì)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用；Fu等[15]檢測(cè)了miR-222-3p在上皮卵巢癌患者、小鼠模型和細(xì)胞系中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-222-3p的高表達(dá)與上皮卵巢癌患者的總體生存率相關(guān)，其表達(dá)水平與體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)。此外，體外實(shí)驗(yàn)表明miR-222-3p抑制上皮卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移，并降低AKT的磷酸化。GNAI2為miR-222-3p的靶標(biāo)，該研究還發(fā)現(xiàn)GNAI2促進(jìn)上皮卵巢癌細(xì)胞增殖，是PI3K/AKT途徑的激活劑，可作為上皮卵巢癌患者新的治療靶點(diǎn)。

本研究顯示，相對(duì)于癌旁組織而言，GNAI2蛋白在食管鱗癌組織中有較高的陽(yáng)性表達(dá)率，我們猜想GNAI2蛋白表達(dá)的上調(diào)很有可能影響著食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。低分化癌組織中GNAI2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于高、中分化組織，表明GNAI2的表達(dá)水平可能與腫瘤進(jìn)展程度有關(guān)。對(duì)于TNM分期，我們可以看到Ⅰ、Ⅱ期食管鱗癌患者相對(duì)于Ⅲ、Ⅳ期患者，GNAI2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者GNAI2的陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，表明在一定程度上患者病情越重，GNAI2表達(dá)水平越高。GNAI2為食管鱗癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素的結(jié)果提示我們GNAI2在食管鱗癌的治療中可以作為預(yù)后判斷的指標(biāo)。并且，根據(jù)生存分析結(jié)果，GNAI2蛋白表達(dá)陽(yáng)性組5年生存率明顯低于陰性組，表明GNAI2蛋白的高表達(dá)可顯著降低食管鱗癌患者的生存率，抑制GNAI2的表達(dá)可能是食管鱗癌靶向治療的潛在分子靶點(diǎn)。

綜上所述，GNAI2與食管鱗癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，GNAI2可能促進(jìn)了食管鱗癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，可以作為食管鱗癌早期診斷和預(yù)后評(píng)估的參考依據(jù)，同時(shí)，抑制GNAI2可能是食管鱗癌靶向治療的潛在靶點(diǎn)之一。