王琪，李一關(guān)，許長山，祝剛強(qiáng)，陳建新*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(合肥包河酒業(yè)有限公司，安徽 合肥，230041) 3(河北衡水老白干酒業(yè)股份有限公司，河北 衡水，053000)

白酒是我國的傳統(tǒng)食品，具有悠久的歷史和文化，是世界六大蒸餾名酒之一[1]。白酒根據(jù)風(fēng)味的不同主要可分為3大類：濃香型白酒、清香型白酒和醬香型白酒，其中濃香型白酒占白酒總產(chǎn)量的70%[2]。濃香型白酒含有120余種酯類，其中己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯和丁酸乙酯最為重要[3]。己酸乙酯和乳酸乙酯為濃香型白酒的主要呈香物質(zhì)。業(yè)界普遍認(rèn)為，濃香型白酒中己酸乙酯和乳酸乙酯保持適當(dāng)?shù)谋壤?如1∶0.5～0.9)，能使?jié)庀阈桶拙浦黧w香突出，香、味協(xié)調(diào)，酒體典型性強(qiáng)[4]；乳酸乙酯過高，主體香受抑制，香味失調(diào)；乳酸乙酯過低，酒味欠濃厚，酒體欠完整[5]。

由于自然界中可產(chǎn)生乳酸的微生物非常多，乳酸與乙醇在酯化酶的作用下生成乳酸乙酯，導(dǎo)致乳酸乙酯在固態(tài)白酒中含量較多，有時甚至超過己酸乙酯，香味失調(diào)，嚴(yán)重影響了白酒的風(fēng)味與質(zhì)量[4]。因此古往今來，“降乳增己”一直是我國很多濃香型白酒企業(yè)面臨的主要技術(shù)問題[6]。發(fā)酵過程中，芽孢梭菌等微生物通過β-氧化逆循環(huán)進(jìn)行的羧酸鏈延長過程合成己酸[7-8]。在該過程中，一般由乙醇或乳酸作為電子供體，相對于乳酸，使用乙醇作為電子供體合成己酸在熱力學(xué)方面具有能量增益的優(yōu)勢[8]。而ZHU等[9]從濃香型白酒發(fā)酵中獲得了代謝乳酸生產(chǎn)己酸鹽的獨(dú)特微生物組，證實(shí)了馴化降乳增己菌的可行性。

傳統(tǒng)濃香型白酒釀造多在窖池中進(jìn)行[10]，窖泥中存在著己酸菌等產(chǎn)生濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的功能微生物[11]，同時窖泥也向酒醅中傳輸其發(fā)酵過程中積累的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，特別是吡嗪類等的微量香味成分使老窖所產(chǎn)白酒比較柔和協(xié)調(diào)[12]。但是，由于窖池中白酒發(fā)酵屬于天然發(fā)酵[13]，難以精準(zhǔn)控制發(fā)酵過程，同時發(fā)酵周期較長。當(dāng)前已有學(xué)者對無泥窖濃香型白酒展開研究[14]，但鮮少有搭建降乳增己體系的報道。本研究旨在以濃香型白酒窖泥樣品中的微生物作為出發(fā)菌群，高乳酸鹽濃度模擬黃水為載體，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行以乳酸轉(zhuǎn)化為己酸為目的的反應(yīng)體系的構(gòu)建，摸索生物反應(yīng)器降乳增己最佳條件，馴化濃香型白酒窖泥中降乳增己菌群，促進(jìn)發(fā)酵液中乳酸至己酸的轉(zhuǎn)化，添加適宜載體培養(yǎng)降乳增己菌群生物膜，得到穩(wěn)定菌群，并將其運(yùn)用于模擬發(fā)酵，探討添加時機(jī)和添加量對白酒發(fā)酵降乳增己的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

白酒發(fā)酵原料(高粱、小麥、麩皮、稻殼、酒曲、酒糟等)、窖泥、出窖酒醅，某酒廠；1 cm改性聚氨酯海綿，江蘇艾勤環(huán)?？萍加邢薰荆?；顆粒狀活性炭，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器與設(shè)備

GC2010氣相色譜儀、GC2010 Plus氣相色譜儀，日本島津公司；VS-1300潔凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；BSP-250生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵，邦西儀器科技(上海)有限公司；1260 Infinity液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；Pico17高速離心機(jī)，美國賽默飛世爾科技公司；定制玻璃反應(yīng)容器，聯(lián)華玻璃儀器廠；HL-2B數(shù)顯恒流泵，上海滬西分析儀器廠有限公司；TF-HX-10智能恒溫循環(huán)器，上海田楓實(shí)業(yè)有限公司；FiveEasy實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，瑞士梅特勒托利多集團(tuán)。

1.2.2 培養(yǎng)基與試劑

強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基(reinforced clostrdium medium，RCM)(g/L)：蛋白胨10，牛肉浸出膏10，酵母膏3，無水葡萄糖5，可溶性淀粉1，NaCl 5，無水乙酸鈉3，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

模擬黃水培養(yǎng)基：在RCM中添加不同量的乳酸鹽模擬發(fā)酵黃水。

甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、乳酸(色譜純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乳酸鈉、乳酸、H3PO4、無水乙醇、ZnSO4、甲醇、NaOH、亞鐵氰化鉀、NaH2PO4，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇(色譜純)，2-乙基丁酸，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 反應(yīng)體系的搭建

在實(shí)驗(yàn)室中搭建反應(yīng)體系，如圖1和圖2所示。

圖1 窖泥反應(yīng)裝置示意圖Fig.1 The biological reactor of pit muds

a-裝置A;b-裝置B;c-裝置C圖2 窖泥反應(yīng)裝置實(shí)體圖Fig.2 The biological reactor of pit muds

在定制玻璃反應(yīng)容器A的2個反應(yīng)器中內(nèi)(容積為1 L)加入改性聚氨酯海綿1 cm正方體至瓶頸處，加入10 g窖泥，將裝置A-1和A-2串聯(lián)，采用夾套控溫法，使用TF-HX-10智能恒溫循環(huán)器控制窖泥反應(yīng)的培養(yǎng)溫度為37 ℃。0～24 d將RCM用HL-2B數(shù)顯恒流泵以0.5 r/min的轉(zhuǎn)速泵入上述反應(yīng)器內(nèi)(流速約為6 mL/h)，24 d后在培養(yǎng)基中加入20%(體積分?jǐn)?shù))乳酸鈉溶液并用乳酸將pH值調(diào)至5.0～5.5模擬黃水進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)，嚴(yán)格控制厭氧培養(yǎng)。

在定制玻璃反應(yīng)容器B的2個柱狀反應(yīng)器中內(nèi)(容積為180 mL)先加入5 g活性炭，再加入改性聚氨酯海綿1 cm正方體至瓶頸處，加入5 g窖泥，具體培養(yǎng)方法同裝置A。

在玻璃裝置C(容積為500 mL)中加入適量改性聚氨酯海綿1 cm正方體后再加入5 g窖泥，水浴37 ℃培養(yǎng)，初始培養(yǎng)基為窖池發(fā)酵黃水，非連續(xù)進(jìn)樣，0～24 d每天固定時間將RCM以6 mL/h進(jìn)料30 mL，24 d后在培養(yǎng)基中加入20%(體積分?jǐn)?shù))乳酸鈉溶液并用乳酸將pH值調(diào)至5.0～5.5，每天以相同速率進(jìn)料30 mL。

收集反應(yīng)液，測定各揮發(fā)性組分含量與乳酸的產(chǎn)量或消耗量的速率，進(jìn)行比較和分析。

1.3.2 揮發(fā)性物質(zhì)濃度的測定

揮發(fā)性物質(zhì)采用氣相色譜儀測定[15]。

1.3.3 乳酸濃度的測定

乳酸濃度采用液相色譜測定[16]。乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=408.69x-10.648，R2=0.998 2。

1.3.4 基因組提取、高通量測序及數(shù)據(jù)處理

基因組提?。何∫欢康木喊l(fā)酵液(強(qiáng)化黃水)，離心棄上清液，超純水洗滌沉淀1次。洗滌后的細(xì)胞基因組提取及純化按照細(xì)菌快速抽提試劑盒說明書進(jìn)行提取。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增：采用原核微生物通用引物338F_806R對上述基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR采用TransGen AP221-02，TransStart Fastpfu DNA Polymerase。

高通量測序分析和數(shù)據(jù)處理：對上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化、連接高通量測序接頭、構(gòu)建DNA文庫及高通量測序(Illumina Miseq)。使用Cutadapt(Martin M., V1.9.1)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾和質(zhì)控后通過UCHIME Algorithm[17]與物種注釋數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對檢測并去除嵌合體序列[18]，得到有效數(shù)據(jù)。利用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001)[19]對有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類。用Mothur方法與SILVA[20]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[21]進(jìn)行物種注釋分析。按最小樣本序列數(shù)抽平后進(jìn)行后續(xù)分析。使用Qiime軟件(Version 1.9.10)和R軟件(Version 2.15.3)進(jìn)行多樣性分析。

1.3.5 實(shí)驗(yàn)室模擬入窖發(fā)酵

濃香型白酒工藝流程主要為高粱粉碎、高溫蒸糧、泥窖發(fā)酵、續(xù)糟配料、混蒸混燒。實(shí)驗(yàn)室模擬發(fā)酵采用單糧發(fā)酵，其中糧醅質(zhì)量比1∶4.5，糧曲質(zhì)量比3∶1，糧水質(zhì)量比1∶0.9，糧食與稻殼質(zhì)量比 4.6∶1。窖池發(fā)酵裝置是定制的容積為9.5 L的不銹鋼桶，高度為35 cm，在潤好的高粱中加入酒廠出窖酒醅，與清蒸稻殼按比例混合均勻后取5 kg裝入定制不銹鋼桶內(nèi)，按表1發(fā)酵條件操作，密封封口后放入培養(yǎng)箱進(jìn)行發(fā)酵，入窖周期為30 d。

表1 模擬發(fā)酵條件Table 1 Conditions of fermentation

發(fā)酵結(jié)束后使用實(shí)驗(yàn)室自主設(shè)計(jì)甑桶蒸餾酒醅酒樣，成品酒中風(fēng)味物質(zhì)用氣相色譜測定。酒醅樣品理化指標(biāo)如還原糖、酸度、淀粉、含水率和酒精度測定采用白酒酒醅分析方法[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 新型窖泥反應(yīng)體系的構(gòu)建

2.1.1 選定實(shí)驗(yàn)裝置

對各裝置中的乙酸、丁酸和己酸含量用氣相色譜測定，結(jié)果如圖3所示。

a-裝置A-1發(fā)酵液；b-裝置A-2發(fā)酵液；c-裝置B-1發(fā)酵液；d-裝置B-2發(fā)酵液；e-裝置C-1發(fā)酵液；f-裝置C-2發(fā)酵液；圖3 各裝置發(fā)酵液中3種酸質(zhì)量濃度Fig.3 Concentration of three acids in fermentation broth of each reactor

由圖3-a和3-b可知，裝置A-2與裝置A-1相比，發(fā)酵液中己酸含量穩(wěn)步提升，表明裝置中產(chǎn)己酸菌活性增強(qiáng)。由圖4-c可知，裝置B-1在培養(yǎng)35 d時出現(xiàn)漏液，重新泵入RCM后己酸含量與裝置B-2相比明顯較低，間接反映通過泵入高乳酸鹽濃度的模擬黃水能夠促進(jìn)反應(yīng)體系中的菌群降解乳酸生產(chǎn)己酸，馴化降乳增己菌群具有可行性。由圖3-d可知，裝置B-2在培養(yǎng)45 d后己酸含量顯著增加，最高達(dá)12.85 g/L，較初始濃度提高9.55倍。由圖3-e和圖3-f可知，裝置C-1和C-2在培養(yǎng)過程中己酸含量降低，增己效果不理想，可能是水浴控溫不穩(wěn)定且不同位置溫度存在略微差異影響反應(yīng)體系內(nèi)的菌體活性，同時非連續(xù)進(jìn)樣可能抑制菌體活力。

表2 四個裝置進(jìn)出料乳酸質(zhì)量濃度 單位：g/L

由表2和圖4可知，裝置A-1在加入模擬黃水后開始具有極高的乳酸轉(zhuǎn)化能力，乳酸轉(zhuǎn)化率高達(dá)81.72%，降乳效果明顯，但隨著培養(yǎng)時間的增加，在41 d后乳酸轉(zhuǎn)化率明顯下降，推測是由于降乳酸菌降乳酸能力達(dá)到閾值。裝置B-1和B-2隨著培養(yǎng)時間的增長，日轉(zhuǎn)化速率波動提高，其中裝置B-2最大日轉(zhuǎn)化速率達(dá)到10.05 g/L。裝置A-1與裝置A-2串聯(lián)，在41 d時裝置A-1中降乳酸菌降乳酸能力達(dá)到飽和，使得裝置A-2進(jìn)料乳酸濃度顯著增加，由圖4可知，此后裝置A-2中乳酸轉(zhuǎn)化率呈正增長，表明通過在反應(yīng)器中提高乳酸鹽含量促進(jìn)降乳酸菌降乳能力具有可行性。綜合3種裝置增己和降乳效果，柱狀反應(yīng)器在連續(xù)進(jìn)料條件下載體與菌群接觸面積更大，有利于固定目的菌群生成生物膜，增強(qiáng)了菌體活力，發(fā)酵液在乳酸含量下降的同時己酸含量增加，降乳增己綜合效果最好，確定用夾套柱狀反應(yīng)器構(gòu)建窖泥降乳增己菌馴化體系。

a-乳酸轉(zhuǎn)化率；b-乳酸轉(zhuǎn)化速率圖4 四個裝置乳酸轉(zhuǎn)化情況Fig.4 Change of lactic acid in four reactors

2.1.2 乳酸鹽添加量的確定

在3個選定的定制玻璃柱狀反應(yīng)器(裝置1、裝置2、裝置3)中先加入5 g活性炭，再加入改性聚氨酯海綿1 cm正方體至瓶頸處，加入5 g窖泥，采用夾套控溫法，使用TF-HX-10智能恒溫循環(huán)器控制窖泥的培養(yǎng)溫度為37 ℃。0～3 d時將RCM用HL-2B數(shù)顯恒流泵以0.5 r/min的轉(zhuǎn)速泵入上述反應(yīng)容器內(nèi)(流速約為6 mL/h)，3 d后在培養(yǎng)基中分別加入40、20、10 g/L乳酸鈉溶液并用乳酸將pH值調(diào)至5.0～5.5，模擬黃水進(jìn)行培養(yǎng)，嚴(yán)格控制厭氧培養(yǎng)。

由圖5可知，在培養(yǎng)過程中，裝置1始終保持較高的乳酸轉(zhuǎn)化率，最高達(dá)41.25%，日轉(zhuǎn)化率達(dá)13.25 g/L。同時由前實(shí)驗(yàn)可知己酸含量穩(wěn)步上升，最高達(dá)10.71 g/L，較初始濃度提高289.2%，這與ZHU等[9]添加乳酸鹽后裝置內(nèi)己酸含量增加的結(jié)果相符。裝置2和裝置3的乳酸轉(zhuǎn)化率最高分別為29.78%和27.12%，己酸最大質(zhì)量濃度為9.22和7.38 g/L。綜合降乳增己情況，在裝置1的操作條件下效果最好，確定模擬黃水中乳酸鹽添加量為40 g/L。

a-乳酸轉(zhuǎn)化率；b-乳酸轉(zhuǎn)化速率圖5 三個裝置乳酸轉(zhuǎn)化情況Fig.5 Change of lactic acid in three reactors

2.2 操作分類單元聚類和物種相對豐度分析

測序結(jié)果經(jīng)過嚴(yán)格的數(shù)據(jù)質(zhì)控，將相似性高于97%的序列聚類成操作分類單元(operational taxonmic units，OTU)。裝置1、2、3中的發(fā)酵液分別對應(yīng)樣本a1、b1、c1。樣本d1為窖泥樣本。由圖6可知，a1、b1、c1、d1四個樣品細(xì)菌共檢出1 567個OTU，其中共有相同種類78個。4個樣品特有的微生物種類分別是10、9、4、693，表明窖泥出發(fā)菌群在馴化過程中，其群落組成可能發(fā)生了變化，發(fā)酵液中降乳增己菌群較窖泥出發(fā)菌群的微生物群落多樣性降低，這與曾田等[23]的研究結(jié)果相符，猜測在馴化過程中優(yōu)勢菌群向降乳增己菌群傾斜。

圖6 基于OTU的Venn圖Fig.6 The venn diagram of operational taxonomic unit

圖7 屬水平上的細(xì)菌物種相對豐度柱形圖Fig.7 The bar graph of bacterial relative abundance of species at genus level

根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果，可以得知不同樣本在域、界、門、綱、目、科、屬、種、OTU等分類水平上的群落結(jié)構(gòu)組成情況。由圖7可知，降乳增己效果最好的裝置1發(fā)酵液中梭菌屬(Clostridium)占主要優(yōu)勢，與目前已報道的產(chǎn)己酸微生物主要集中在Clostridium屬，如C.kluyveri,C.sp.BS-1和C.celerecrescens等[24-25]的結(jié)論相符。胡曉龍等[26]對河南某濃香型白酒企業(yè)35年窖齡窖泥微生物用高通量測序技術(shù)進(jìn)行解析，得到優(yōu)勢菌屬為厚壁菌門與擬桿菌門，與本研究結(jié)果相似。同時，Aminobacterium屬也顯著增多，其參與降解氨基酸[27-28]，很可能與提供窖泥菌群豐富的銨態(tài)氮有關(guān)。栗連會[29]報道了濃香型白酒釀造環(huán)境中的Bacillus和Clostridium等物種具有降乳酸能力，如C.cochlearium乳酸利用率高達(dá)94.1%。在馴化過程中，優(yōu)勢菌群向Clostridium和Aminobacterium傾斜驗(yàn)證了反應(yīng)體系降乳增己菌群馴化的可行性。裝置2和裝置3發(fā)酵液中梭菌屬(Clostridium)與窖泥出發(fā)微生物相比也有顯著增加，與己酸含量增加的結(jié)果相符，表明通過生物反應(yīng)器構(gòu)建降乳增己體系具有可行性。

2.3 發(fā)酵應(yīng)用

2.3.1 發(fā)酵罐理化指標(biāo)變化分析

在發(fā)酵過程中酸度、水分、淀粉、酒精含量等酒醅理化指標(biāo)與最終原酒的品質(zhì)息息相關(guān)。發(fā)酵30 d后酒醅中的各項(xiàng)理化指標(biāo)如表3所示。

表3 發(fā)酵罐中酒醅理化指標(biāo)Table 3 Physical and chemical indicators of fermenting grains

由表3可知，4個發(fā)酵罐中的酒醅理化指標(biāo)偏差不大，某些指標(biāo)有細(xì)微差別，表明添加強(qiáng)化黃水對白酒發(fā)酵的過程干擾較小，具有放大實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于工廠的實(shí)際意義。添加了強(qiáng)化黃水的發(fā)酵罐中酒醅的酸度高于未添加的對照組，可能和強(qiáng)化黃水中的優(yōu)勢菌Clostridium屬產(chǎn)己酸[24-25]以及Proteiniphilum屬產(chǎn)乙酸和丙酸等有關(guān)[30]。在發(fā)酵初始添加強(qiáng)化黃水的發(fā)酵罐酒醅中水分最高，水是微生物代謝的產(chǎn)物，在發(fā)酵過程中逐漸累積，推測在發(fā)酵初始含有豐富微生物的強(qiáng)化黃水的添加使得酒醅發(fā)酵中的微生物量或多樣性增加，代謝較對照組旺盛，故水分及酸度較高，同時糖化力的增強(qiáng)使得淀粉消耗量以及還原糖含量偏高，這與夏培禹等[31]將復(fù)合窖泥功能菌液應(yīng)用于濃香型白酒生產(chǎn)測得的酒醅理化指標(biāo)結(jié)果相符。表明添加強(qiáng)化黃水在不影響白酒正常發(fā)酵的情況下對白酒風(fēng)味與品質(zhì)的提高有積極作用。

2.3.2 發(fā)酵原酒成分分析

發(fā)酵結(jié)束后使用實(shí)驗(yàn)室自主設(shè)計(jì)甑桶蒸餾酒醅酒樣，成品酒中風(fēng)味物質(zhì)用氣相色譜測定。成分分析如表4所示。

由表4可知，添加了強(qiáng)化黃水的發(fā)酵罐2和4發(fā)酵原酒中己酸乙酯明顯高于未添加強(qiáng)化黃水的對照組1和3。對照組中的乳酸乙酯含量均高于己酸乙酯，使白酒主體香受抑制、香味不突出。在0 d添加70 mL強(qiáng)化黃水發(fā)酵罐的發(fā)酵原酒中己酸乙酯含量高達(dá)561.9 mg/L，較未添加強(qiáng)化黃水對照組提高330.9%，但同時乳酸乙酯含量也有所提升。而發(fā)酵7 d后添加強(qiáng)化黃水的原酒與對照組相比己酸乙酯增加154.6%的同時乳酸乙酯下降9.8%，m(己酸乙酯)∶m(乳酸乙酯)≈1∶0.62，比例合宜。說明白酒發(fā)酵中添加強(qiáng)化黃水有利于增加己酸乙酯含量、降低乳酸乙酯及乙酸乙酯的含量。己酸及丁酸均為合成己酸乙酯的前體物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)組中己酸及丁酸的產(chǎn)生量要高于對照組，推測強(qiáng)化黃水的添加可使發(fā)酵過程中的產(chǎn)己酸等合成己酸乙酯前體物質(zhì)微生物增殖，進(jìn)而促使實(shí)驗(yàn)組中己酸乙酯的含量相對增高。表4中甲醇含量異常，可能是由于實(shí)驗(yàn)室稻殼存放過久累積大量甲醇，清蒸稻殼時間把握不到位，沒能將稻殼中甲醇等不良物質(zhì)去除徹底所致。強(qiáng)化黃水中豐富的微生物在白酒發(fā)酵過程中起到了積極的作用，尤其是降乳增己菌群，驗(yàn)證了添加強(qiáng)化黃水在白酒發(fā)酵過程中降乳增己的可行性，為濃香型白酒生產(chǎn)過程中降乳增己的實(shí)現(xiàn)提供理論支持。

表4 發(fā)酵原酒成分分析Table 4 Comparison of compounds in different samples

3 討論與結(jié)論

本研究以某酒廠正常窖泥為原料，用定制柱狀反應(yīng)器搭建新型窖泥反應(yīng)體系，采用夾套控溫法，控制窖泥反應(yīng)的培養(yǎng)溫度為37 ℃。將RCM以0.5 r/min的轉(zhuǎn)速泵入上述反應(yīng)容器內(nèi)(流速約為6 mL/h)活化窖泥菌群后，在培養(yǎng)基中加入40 g/L乳酸鈉溶液并用乳酸將pH值調(diào)至5.0～5.5模擬黃水進(jìn)行培養(yǎng)，馴化降乳增己菌群效果顯著，己酸最高質(zhì)量濃度達(dá)10.71 g/L，較初始濃度提高289.2%，乳酸利用率最高達(dá)41.25%。柱狀反應(yīng)器中載體與菌體接觸面積大，有利于菌體附著生成生物膜從而提高菌體產(chǎn)能，高濃度乳酸鹽的添加促進(jìn)了降解乳酸合成己酸的微生物的增殖，降低乳酸含量的同時增加己酸含量。

對上述發(fā)酵液和窖泥樣本進(jìn)行高通量測序分析，馴化后的菌群較窖泥出發(fā)菌群的微生物群落多樣性降低，優(yōu)勢菌群向降乳增己相關(guān)菌群傾斜，其中梭菌屬(Clostridium)占主要優(yōu)勢，而大量研究表明梭菌屬(Clostridium)與生產(chǎn)己酸和降解乳酸息息相關(guān)。

將上述發(fā)酵液運(yùn)用于白酒模擬發(fā)酵，不同階段添加70 mL強(qiáng)化黃水發(fā)酵得到的原酒中己酸乙酯含量均比未添加強(qiáng)化黃水的對照組高。在0 d添加70 mL強(qiáng)化黃水發(fā)酵罐的發(fā)酵原酒中己酸乙酯含量高達(dá)561.9 mg/L，較未添加強(qiáng)化黃水對照組提高330.9%。而發(fā)酵7 d后添加強(qiáng)化黃水的發(fā)酵原酒與對照組相比己酸乙酯增加154.6%的同時乳酸乙酯下降9.8%，m(己酸乙酯)∶m(乳酸乙酯)≈1∶0.62，比例合宜，驗(yàn)證了添加強(qiáng)化黃水在白酒發(fā)酵過程中降乳增己的可行性。不同階段添加強(qiáng)化黃水得到的原酒在乳己比上存在一定差異，添加時機(jī)和添加量對白酒發(fā)酵降乳增己的影響還有進(jìn)一步探討的空間。

“降乳增己”是提高濃香型白酒質(zhì)量的關(guān)鍵技術(shù)，主要研究如何科學(xué)合理地在降低乳酸乙酯含量同時增加己酸乙酯含量，使酒體香味協(xié)調(diào)。本研究尚有很多進(jìn)步空間，例如摸索培養(yǎng)條件進(jìn)一步提高發(fā)酵液中己酸含量，對馴化得到的降乳增己菌群進(jìn)行深入研究，明晰其降乳增己的反應(yīng)機(jī)理。同時，在白酒發(fā)酵中添加強(qiáng)化黃水對提高白酒風(fēng)味與品質(zhì)具有積極作用，不同操作條件得到的白酒品質(zhì)不同，添加時機(jī)和添加量對白酒發(fā)酵降乳增己的影響還需要進(jìn)一步的探討。