鄭春磊，呂楊俊，朱建紅，蔣玉蘭，潘俊嫻，施昌衍，王孔錫，朱躍進(jìn)

（1.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016； 2.浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310016；3.衢州市衢江區(qū)檢驗(yàn)檢測中心，浙江衢州 324022； 4.龍游圣堂茶業(yè)專業(yè)合作社，浙江衢州 324022；5.瑞安市云頂農(nóng)業(yè)專業(yè)合作社，浙江瑞安 325200）

青錢柳（Cylocaryapaliurus （Batal.） Iljinskaja）是我國特有的瀕危樹種，在降 “三高”、抗氧化、抗菌、抗癌等方面具有顯著功效[1-6]，被譽(yù)為 “醫(yī)學(xué)界的第三棵樹”。 2013 年，國家衛(wèi)計(jì)委將青錢柳葉列為新資源食品[7]，為其開發(fā)利用提供新契機(jī)。 研究表明，青錢柳多糖是青錢柳的主要功能成分，在青錢柳葉、根、枝、莖等各個(gè)部位均有分布，且以葉片中含量最高[8]，具有降血糖、降血脂、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等功能[9-11]。 近年，有關(guān)青錢柳多糖的研究主要圍繞提取分離（純化）、功能評價(jià)及機(jī)制研究、分子修飾、 深加工產(chǎn)品開發(fā)等方面，其中提取分離（純化）是各領(lǐng)域研究開展的基礎(chǔ)，亦是當(dāng)下青錢柳資源深加工開發(fā)利用的熱點(diǎn)之一。

青錢柳多糖以分子量300 kDa 以上的大分子多糖為主（69.5%），由半乳糖、葡萄糖、 阿拉伯糖、鼠李糖等單糖組成，易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑[12-15]。 當(dāng)前，青錢柳多糖的提制主要是在植物多糖提制方法的基礎(chǔ)上展開工藝優(yōu)化，包括提取和分離純化兩個(gè)模塊。 基于此，文章綜述了青錢柳多糖提取分離技術(shù)的研究現(xiàn)狀，以期為青錢柳多糖的提取分離、開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 青錢柳多糖提取技術(shù)

1.1 熱水直接浸提

植物多糖的提取技術(shù)已相對成熟，一般先采用熱水將多糖浸出，進(jìn)而利用多糖不溶于有機(jī)溶劑的性質(zhì)，加入無水乙醇等有機(jī)溶劑沉淀得到粗多糖[16-18]。 青錢柳多糖作為植物多糖的一種，通常也采用水提法進(jìn)行粗提[19]。 粗提過程主要受提取時(shí)間、溫度、料液比、次數(shù)等因素的影響，因不同植物間多糖的組成及理化特性存在差異，其提取參數(shù)也有所不同。

研究表明，青錢柳在水提的條件下，其多糖得率與提取溫度（60~100 ℃）、次數(shù)（1~3 次）、時(shí)間（60~150 min）呈正相關(guān)性，與料液比（1∶6~1∶10）呈負(fù)相關(guān)性，并在較優(yōu)條件下趨于穩(wěn)定[15]。 謝建華等[15]研究表明，在90 ℃水浴條件下，影響青錢柳多糖得率的因素順序?yàn)椋禾崛〈螖?shù)＞時(shí)間＞料液比，且在優(yōu)化的工藝條件下（提取次數(shù)3 次，時(shí)間150 min，料液比1∶8），青錢柳多糖得率達(dá)6.54%。陳木森等[14]通過100 ℃水浴提取，正交優(yōu)化提取時(shí)間、料液比、pH 值等參數(shù)，結(jié)果表明，影響青錢柳多糖得率的因素順序?yàn)椋?料液比＞時(shí)間＞pH 值，最佳工藝為料液比1∶20，時(shí)間7 h，pH 9.0。 此外，熱水浸提前，也可通過80%乙醇回流的方法脫除青錢柳葉中單糖、低聚糖、多酚、氨基酸等醇溶性雜質(zhì)，水提后進(jìn)一步利用醇沉的方法沉淀獲得青錢柳粗多糖[20]。

常規(guī)水提法具有操作簡單、得率高、設(shè)備投入小等優(yōu)點(diǎn)，是工業(yè)化提取植物多糖最為普及的方法，但也存在提取時(shí)間長、高溫破壞多糖活性、浸提液量大濃縮耗時(shí)耗力等缺點(diǎn)。

1.2 輔助提取

為提高熱水直接浸提的效率，可通過稀堿處理、酶解、超微粉碎、超聲波、微波等技術(shù)進(jìn)行輔助提取[21-23]，利用細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、熱效應(yīng)、機(jī)械作用及空化效應(yīng)等方式提高傳質(zhì)效率，加快可溶性固形物的浸出。

1.2.1 超聲、微波輔助提取

上官新晨等[24]利用超聲波法輔助提取青錢柳多糖，研究了超聲功率、時(shí)間、料液比對青錢柳多糖得率的影響，結(jié)果表明，超聲功率和時(shí)間是影響青錢柳多糖得率的關(guān)鍵因素，最佳提取工藝為：時(shí)間70 min，功率1200 W，料液比1∶10。 應(yīng)瑞峰等[25]采用青錢柳超微粉-超聲-微波復(fù)合法提取多糖，先通過超微粉碎技術(shù)對青錢柳進(jìn)行超微粉碎，提高比表面積，再結(jié)合超聲-微波技術(shù)進(jìn)一步提高多糖在熱水中的浸出率，通過參數(shù)優(yōu)化，青錢柳多糖得率和純度分別達(dá)10.02%、26.11%，不僅將提取時(shí)間縮短為20 min，同時(shí)顯著提高青錢柳多糖得率、純度及降血糖、抗腫瘤和抗氧化的生物活性。但超聲、 微波輔助提取法對設(shè)備和工人技術(shù)水平等要求較高，目前仍未在青錢柳多糖提取中工業(yè)化應(yīng)用。

1.2.2 酶解輔助提取

微生物發(fā)酵（酶解）法亦是破壞植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、提高多糖浸出率的有效方法。 鄭曉杰等[26]公開了一種提取青錢柳多糖的方法，主要通過酶解-乙醇溶液超聲-二次酶解的工藝-熱水浸提的工藝提取制備青錢柳多糖，第一次酶解是為了去除單糖、雙糖、低聚糖、生物堿等雜質(zhì)，第二次酶解是為了充分釋放多糖； 該法所得青錢柳多糖得率可達(dá)10.53%。 魯青等[27]采用微生物發(fā)酵法同步提取青錢柳多糖和黃酮，在纖維素酶、半纖維素酶酶解基礎(chǔ)上，接種黑曲霉、枯草芽孢桿菌等微生物，通過酶和微生物聯(lián)合處理破壞青錢柳細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，提高了青錢柳多糖和黃酮的提取率。 該法存在發(fā)酵提取時(shí)間長（2 d），引入微生物菌體、次級代謝產(chǎn)物等新雜質(zhì)等問題，有待進(jìn)一步攻克。

1.2.3 其他方法

鄭曉杰等[28]發(fā)明了一種青錢柳脈沖電場提取裝置，該裝置包括速凍、 擊碎和高壓脈沖提取裝置，先通過液氮實(shí)現(xiàn)青錢柳的速凍，再利用擊碎裝置將速凍青錢柳擊碎，最后采用高壓脈沖提取裝置達(dá)到青錢柳多糖等內(nèi)含物質(zhì)的高效提取。 但該裝置的具體應(yīng)用實(shí)例未見報(bào)道。

2 青錢柳多糖分離純化技術(shù)

粗提制得的青錢柳多糖，多為黑褐色，純度較低（一般＜30%），需要進(jìn)一步脫除色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，進(jìn)而分離純化得到較高純度的多糖。

2.1 脫色

葉綠素、黃酮類、酚類、胡蘿卜素、皂苷類等色素是植物多糖的主要雜質(zhì)之一，影響產(chǎn)品純度及品質(zhì)，同時(shí)對其定性定量分析和功能作用研究等存在干擾[29]。 植物多糖脫色方法通常有：活性炭法、過氧化氫法、柱層析法、離子交換樹脂法、反膠束法等，對于同時(shí)含有游離蛋白質(zhì)和色素的多糖，也可通過生成金屬絡(luò)合物的方法，同時(shí)除去蛋白和色素。 其中，活性炭法具有安全、無毒、可再生、易去除、不破壞多糖理化性質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，受到廣泛應(yīng)用，但該法脫色率偏低，對脂溶性色素和與糖結(jié)合性色素的脫除效果較差； 雙氧水法適用于與糖結(jié)合性色素的脫除；柱層析法對黃酮類、酚類等色素具有特異吸附脫除的作用。 謝建華等[29]研究表明，活性炭吸附法對青錢柳多糖具有良好的脫色效果，并優(yōu)化獲得最佳工藝條件：溫度40 ℃，時(shí)間20 min，活性炭用量1.0%，pH 值3.5。 但鮑若晗等[30]的研究表明，青錢柳多糖經(jīng)過超聲鋪助提取后（純度達(dá)16.5%），采用活性炭脫色，工藝為活性炭添加量0%~1.4%，脫色時(shí)間30~70 min，結(jié)果表明該工藝條件下活性炭脫色效果不明顯，且對多糖有較大的吸附。

柱層析、 離子交換樹脂等方法在青錢柳多糖脫色中的應(yīng)用常以多糖特異性吸附純化為目的，雙氧水法主要通過氧化降解多糖中的色素類物質(zhì)達(dá)到脫色效果。 謝建華團(tuán)隊(duì)[31]研發(fā)了一種超聲-雙氧水結(jié)合大孔樹脂的青錢柳多糖的脫色方法，該方法采用雙氧水法降解色素，并利用超聲提高雙氧水的脫色效率，再通過AB-8 樹脂進(jìn)一步富集青錢柳多糖，起到雙效脫色的作用，脫色率可達(dá)80.1%，多糖保留了75.1%。 當(dāng)前，有關(guān)反膠束法在青錢柳多糖脫水中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。

2.2 脫蛋白

天然植物多糖與蛋白的分子量相近，且兩者常常會形成糖蛋白復(fù)合物，因此多糖中蛋白的脫除率較低，往往還伴隨多糖的大量損失。 目前，植物多糖脫蛋白常用的方法主要包括Sevage 法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、酶法等[32]，前三種方法需要氯仿、正丁醇、三氟三氯乙烷、三氯乙酸等有機(jī)溶劑，存在操作人員安全危害、污水處理和環(huán)境污染等問題； 酶法脫除蛋白相對溫和，但成本高，易引入新的蛋白。 謝建華等[32]對比了Sevage法、三氯乙酸法、鹽酸法、酶法（胰蛋白酶）聯(lián)合Sevage 法等四種經(jīng)典脫蛋白方法對青錢柳多糖的脫蛋白效果，結(jié)果表明，四種方法均造成青錢柳多糖較大的損失，這可能是由于脫蛋白工藝引起多糖與蛋白復(fù)合物的損失。 其中，酶解和Sevage 聯(lián)用法在實(shí)現(xiàn)較高蛋白脫除率（47.72%）的同時(shí)能獲得最高的多糖得率（59.26%），說明此法較其他方法更適合于青錢柳多糖提取液中蛋白質(zhì)的脫除。

2.3 純化

經(jīng)蛋白和色素脫除處理后的多糖通常是不同分子量多糖的混合物，其化學(xué)組成、聚合度是不均一、多分散性的，可通過進(jìn)一步的純化得到較高純度的單一多糖。 純化方法常用有沉淀法、 層析法等，此外，還包括透析法、超速離心法、區(qū)域電泳法及膜技術(shù)等[33]。

陳木森等[14]利用石油醚將青錢柳葉脫脂脫色，晾干后用水提取，所得濾液經(jīng)濃縮、Sevage 法脫蛋白、醇沉后，研究不同樹脂對青錢柳多糖的靜態(tài)吸附性能，篩選出一種吸附較好的樹脂（D301R），并利用柱層析進(jìn)行青錢柳多糖的純化研究。結(jié)果表明，D301R 樹脂對青錢柳多糖吸附量最大，較優(yōu)吸附條件為：吸附溫度30 ℃，pH7.0，濃度4.0 mg/mL，流速1.5 mL/min；較優(yōu)洗脫劑為0.4 mol/L NaCl，洗脫率達(dá)82.12%。 謝建華等[32]運(yùn)用Sephacryl-400 葡聚糖凝膠層析柱與大分子純化系統(tǒng)AKTA Purifier 100 聯(lián)用對精制后的青錢柳多糖進(jìn)行純化，獲得一個(gè)青錢柳多糖中的主要組分，通過一系列的理化性質(zhì)研究，表明該多糖為淺黃色粉末，溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等有機(jī)溶劑。

綜上可見，青錢柳多糖的提取分離技術(shù)以植物多糖常用的技術(shù)為主，且由于青錢柳產(chǎn)業(yè)化起步較晚，其工廠化提取分離多為粗提，分離純化較為少見。

3 展望

多糖是天然植物功能物質(zhì)研究的熱點(diǎn)，其提取分離技術(shù)研究已有大量報(bào)道，為青錢柳多糖的提取分離奠定夯實(shí)的基礎(chǔ)。 然而，因青錢柳種子果皮堅(jiān)硬具有深休眠特性，自然育種率低（0.1%~0.2%）[34-35]，且青錢柳為強(qiáng)陽性樹種，幼苗在林蔭環(huán)境下難以生長[36]，導(dǎo)致青錢柳自然林種群瀕臨滅絕，被列為國家二級保護(hù)樹種。 青錢柳資源較為稀缺、 青錢柳葉價(jià)格昂貴是青錢柳功能物質(zhì)提取分離產(chǎn)業(yè)化推廣的主要難題之一。 為降低青錢柳多糖的提取成本、提高得率，不少學(xué)者開始關(guān)注青錢柳多糖提取原料的篩選、培育。 上官新晨等[37]采用生物反應(yīng)器規(guī)模化生產(chǎn)青錢柳多糖，幾種大量營養(yǎng)素對青錢柳懸浮細(xì)胞生長及多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響較大，正交試驗(yàn)結(jié)果表明：培養(yǎng)液中添加40 g/L 的蔗 糖、30 mmol/L 總氮、3 mmol/L Mg2+、3 mmol/L Ca2+，較利于青錢柳細(xì)胞多糖含量提高（37.95 mg/g）。生物反應(yīng)器法具有周期短、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，避免了青錢柳資源匱乏、栽種周期長等問題，將為青錢柳功能成分的提取分離和開發(fā)應(yīng)用提供新出路。