史亞婷 劉雁峰 奚婷 曹一鳴 王悅竹 宮瑋珩

摘要?目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法探討壽胎丸治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（RSA）的主要作用機(jī)制。方法：運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索壽胎丸所含主要的活性化學(xué)成分，并在TCMSP數(shù)據(jù)庫中查詢藥物成分對應(yīng)靶點(diǎn)，檢索GeneGards數(shù)據(jù)庫獲得RSA相關(guān)靶點(diǎn)。運(yùn)用R軟件取藥物與疾病靶點(diǎn)的交集制成韋恩圖，再利用Cytoscape 3.7.2軟件將藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)可視化，通過STRING數(shù)據(jù)庫獲得靶標(biāo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。最后運(yùn)用R軟件對靶點(diǎn)基因進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析。結(jié)果：共得出主要活性成分21個，壽胎丸與RSA相關(guān)靶點(diǎn)共108個，通過GO分析得出133個功能條目，通過KEGG分析得出147條信號通路，涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活動、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等功能及AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化等通路。分子對接驗(yàn)證顯示，壽胎丸的主要活性成分與RSA核心靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的結(jié)合活性，為二者的相互作用提供了基礎(chǔ)。結(jié)論：該研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步揭示了壽胎丸通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療RSA的作用機(jī)制，預(yù)測了壽胎丸可能通過TGF-β、PI3K/AKT、MAPK、JAK-STAT等通路保護(hù)妊娠，為進(jìn)一步臨床及實(shí)驗(yàn)研究提供了良好的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞?壽胎丸;復(fù)發(fā)性流產(chǎn);網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對接;靶點(diǎn);蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò);信號通路;作用機(jī)制

Abstract?Objective Based on network pharmacology and molecular docking method，to explore the main mechanism of Shoutai Pill in the treatment of recurrent spontaneous abortion（RSA）.Methods TCMSP and BATMAN-TCM databases were used to retrieve the main active chemical constituents in the pill.Corresponding drug targets were searched in the TCMSP database，and RSA related targets were retrieved in Gene Gards database.R software was used to take the intersection of drugs and disease targets to generate the Wynn diagram，and Cytoscape3.7.2 software was used to visualize the drug-active component-target-disease network.The PPI network of target protein interaction was obtained through STRING database.Finally，the target genes were performed GO and KEGG analysis with R software.Results It was concluded that there were 21 main active ingredients a total of 108 entries associated with the RSA，133 items from GO analysis，147 signaling pathways through KEGG analysis，involving the functions of cytokine receptor binding，receptor ligand activity，ubiquitin-like protein ligase binding and signaling pathways of AGE-RAGE signaling pathways in diabetic complications，fluid shear stress and atherosclerosis.The molecular docking verification showed that the main active components of Shoutai Pill had strong binding activity with RSA core targets，which provided a foundation for the interaction between the two.Conclusion In this study，network pharmacology was used to reveal the mechanism of Shoutai Pill in the treatment of RSA through multiple components，targets and pathways，and it was predicted that Shoutai Pill might protect pregnancy through TGF-β，PI3K/AKT，MAPK，JAK-STAT and other pathways，which provided a good theoretical basis for further clinical and experimental studies.

Keywords?Shoutai Pill; Recurrent spontaneous abortion; Network pharmacology; Molecular docking; Protein-protein interaction network; Target; Signaling pathway; Mechanism of action

中圖分類號：R285;R271.41文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.22.007

近年來隨著生育政策的調(diào)整，妊娠率的增加，流產(chǎn)尤其是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)也越來越被人們所重視。對于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（Recurrent Spontaneous Abortion，RSA）的定義，不同國家和地區(qū)也有著些許不同[1-2]，我國雖然將RSA定義為妊娠28周之前發(fā)生3次或3次以上的胎兒丟失[3]，但大多數(shù)專家認(rèn)為，由于連續(xù)發(fā)生2次后再次流產(chǎn)的風(fēng)險與3次者相近，故胎兒丟失在發(fā)生2次時即應(yīng)予以重視及評估[4]。近年來多項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，RSA在育齡女性中的發(fā)病率已達(dá)到1%～5%[5]，并呈上升趨勢。此病病因錯綜復(fù)雜，可單純一種因素，也可多種因素并存。現(xiàn)仍有約半數(shù)的病例為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，且無法解釋的流產(chǎn)發(fā)生率呈日益上升趨勢。反復(fù)宮腔操作造成的子宮內(nèi)膜損傷及宮腔粘連，也是繼發(fā)性不孕的重要原因之一。同時，因其治療困難，且手術(shù)治療、輔助生殖技術(shù)費(fèi)用昂貴、創(chuàng)傷較大，造成育齡期女性身體及精神方面的雙重負(fù)擔(dān)。中醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)整體觀念，辨病與辨證相結(jié)合，組方多因人而異，不僅能增加協(xié)同效應(yīng)，增強(qiáng)人體免疫，還具有不良反應(yīng)少、適用范圍廣、療效顯著等特點(diǎn)。

中醫(yī)學(xué)無“復(fù)發(fā)性流產(chǎn)”的病名，在中醫(yī)古籍中并無記載，根據(jù)其發(fā)病特點(diǎn)及臨床表現(xiàn)，我們將其歸屬于中醫(yī)“滑胎”的范疇，亦稱“數(shù)墮胎”“屢孕屢墮”?！度~氏女科證治·安胎》提出：“有屢孕屢墮者……名曰滑胎?！薄夺t(yī)宗金鑒·婦科心法要訣》中又有：“數(shù)數(shù)墮胎，則謂之滑胎?！敝嗅t(yī)學(xué)對滑胎的認(rèn)識源遠(yuǎn)流長，有良好的效果，優(yōu)勢明顯。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為母體沖任損傷和胎元不健是滑胎的主要機(jī)制[6]。有研究統(tǒng)計分析了近15余年復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中醫(yī)證治規(guī)律，發(fā)現(xiàn)RSA的常見證型分別為脾腎兩虛型、腎氣虧損型、氣血兩虛型、腎虛血瘀型，治療多釆用辨證分型論治[7]。

壽胎丸為清代張錫純?yōu)轭A(yù)防和治療滑胎所設(shè)，功用補(bǔ)腎安胎，為安胎基礎(chǔ)方。方中菟絲子“大能補(bǔ)腎”，補(bǔ)腎益精，固攝沖任;桑寄生、續(xù)斷補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，一則補(bǔ)益母體，固腎強(qiáng)腰以系胎，二則強(qiáng)壯胎氣;阿膠為血肉有情之品，“最善伏藏血脈”，養(yǎng)血以補(bǔ)后天，亦有收斂之效，固澀止血安胎，壽胎丸全方合用共奏補(bǔ)腎養(yǎng)血、固攝沖任安胎之效。

本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選壽胎丸主要活性化學(xué)成分，獲取藥物作用于疾病的相關(guān)靶點(diǎn)，構(gòu)建生物信息網(wǎng)絡(luò)，探討壽胎丸治療RSA的作用機(jī)制，為深入臨床及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?篩選壽胎丸主要活性化學(xué)成分?通過TCMSP、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫查詢壽胎丸中4種中藥的化學(xué)成分，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug-Likeness，DL）≥0.18為篩選條件選取有效成分，最終獲取4種中藥中生物活性較高的化合物成分[8]。

1.2?獲取壽胎丸活性成分靶點(diǎn)及RSA相關(guān)作用靶點(diǎn)?在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）的Herb Name/Chemical Name中輸入中藥名或者化合物名稱，對上述化合物對應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行提取，通過UniProt數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化處理所得靶點(diǎn)，得到壽胎丸4種中藥主要活性成分的對應(yīng)靶點(diǎn)的基因名。基于GeneCards數(shù)據(jù)庫，通過關(guān)鍵詞“Recurrent Spontaneous Abortion”檢索出與RSA疾病相關(guān)的靶點(diǎn)基因。

1.3?預(yù)測藥物作用于疾病的相關(guān)靶點(diǎn)?應(yīng)用R軟件將壽胎丸靶點(diǎn)基因與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)靶點(diǎn)基因取交集生成韋恩圖，得出壽胎丸干預(yù)RSA的可能有效靶基因。

1.4?構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)?通過Cytoscape 3.7.2軟件可視化，將壽胎丸活性成分、藥物和疾病的靶基因交集等文件導(dǎo)入，構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。將藥物與疾病共有靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫，以“Homo Sapiens”為限定物種，設(shè)定Minimum Required Interaction Score≥0.9，獲得靶標(biāo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)出網(wǎng)絡(luò)圖并輸出tsv格式文件。借助R軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)的參數(shù)進(jìn)行分析，篩選出關(guān)鍵核心基因。

1.5?靶點(diǎn)基因功能分析及作用通路分析?為了解壽胎丸通過調(diào)節(jié)機(jī)體的何種功能來達(dá)到治療疾病的目的，須對基因進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。運(yùn)用R軟件對藥物與疾病的交集靶基因進(jìn)行富集分析，物種限定為Homo Sapiens。經(jīng)可視化處理，GO富集分析得出柱狀圖及氣泡圖，KEGG通路分析得出柱狀圖、氣泡圖、通路圖。

1.6?活性成分-核心靶點(diǎn)的分子對接驗(yàn)證?根據(jù)藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)的Degree值選取排名靠前的壽胎丸主要活性成分與疾病核心靶點(diǎn)。在ChemDraw Ultra 17.0中畫出核心成分的分子結(jié)構(gòu)，然后通過ChemBio3D Ultra 17.0進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，從RCSB Data Bank（www.rcsb.org）可下載三維結(jié)構(gòu)，再運(yùn)用MMFF94力場將其優(yōu)化。采用AutodockTools 1.5.6[9-10]將靶點(diǎn)蛋白和小分子轉(zhuǎn)化為PDBQT格式，通過Autodock vina 1.1.2[11]進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。為了增加計算的準(zhǔn)確度，將參數(shù)Exhaustiveness設(shè)置為20。最后，選取分值最高的構(gòu)象用Schrodinger 2019.1進(jìn)行結(jié)果分析。

2?結(jié)果

2.1?壽胎丸主要活性成分的篩選?本研究利用TCMSP、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索到21個壽胎丸主要活性成分，其中桑寄生2個，續(xù)斷8個，菟絲子11個。因TCMSP中無中藥阿膠化合物結(jié)果，故在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中查詢獲得有效化合物3個。去除重復(fù)后最終共得到21個有效活性化合物。按OB值降序排列。見表1。

2.2?壽胎丸治療RSA的靶點(diǎn)預(yù)測?取21個主要活性成分的作用靶點(diǎn)與RSA相關(guān)靶點(diǎn)的交集得出壽胎丸治療RSA相關(guān)靶點(diǎn)共108個，繪制韋恩圖。見圖1。

2.3?藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建?在Cytoscape 3.7.2軟件中繪制藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)?？梢娋W(wǎng)絡(luò)圖中共包含125個節(jié)點(diǎn)和425條邊。見圖2。

2.4?PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建?通過STRING平臺構(gòu)建壽胎丸與RSA蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。共有108個節(jié)點(diǎn)，331條邊。見圖3。此處節(jié)點(diǎn)代表蛋白，每條邊則表示蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，邊數(shù)與關(guān)聯(lián)度成正比。靶蛋白的平均節(jié)點(diǎn)度為6.13。通過R軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)的參數(shù)進(jìn)行分析，篩選出前30個關(guān)鍵核心基因進(jìn)行可視化。見圖4。

2.5?GO及KEGG富集分析?運(yùn)用R軟件對以上所得靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，共獲得133個功能條目，排名前20的GO條目繪制柱狀圖。見圖5。分析得出靶點(diǎn)富集較集中的表現(xiàn)在細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活動、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性、激酶調(diào)節(jié)活動、細(xì)胞因子活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合、肽鏈內(nèi)切酶活性等方面。KEGG富集分析篩選出信號通路147條，其中基因數(shù)目富集較多的有AGE-RAGE Signaling Pathway in Diabetic Complications、Fluid Shear Stress and Atherosclerosis、Hepatitis B、Proteoglycans in Cancer、PI3K-AKT Signaling Pathway等通路，顯示顯著性較高的前20條通路可視化。見圖6。所含基因數(shù)目最多的通路。見圖7。

2.6?分子對接驗(yàn)證?為了進(jìn)一步驗(yàn)證以上網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)模擬得出的結(jié)論，對壽胎丸主要活性成分及RSA核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接研究。我們將小分子與靶點(diǎn)蛋白的活性口袋進(jìn)行對接以闡明其在分子水平的作用模式，其結(jié)合能見表2。選取結(jié)合最好的分子與靶點(diǎn)，分子MOL000184和蛋白AKT1，作圖分析見圖8。由表面圖可與看出分子位于蛋白的活性空腔內(nèi)，且二者有較好的匹配，為了二者的相互作用提供了基礎(chǔ)。見圖9。由相互作用圖可以看出，MOL000184結(jié)合到蛋白活性位點(diǎn)，并且和活性位點(diǎn)附近的LYS 158、ALA 230、GLU228和ASP292共4個氨基酸形成氫鍵相互作用。見圖10。

3?討論

近年來多項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示臨床中RSA發(fā)病率明顯上升。這不管是對育齡期婦女身心健康還是對家庭和諧幸福都是極大的傷害，對生殖醫(yī)學(xué)和婦產(chǎn)科學(xué)都是一項(xiàng)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。中醫(yī)學(xué)將復(fù)發(fā)性流產(chǎn)歸屬于“滑胎”的范疇，壽胎丸出自清代張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，專為“滑胎”所設(shè)，功用補(bǔ)腎養(yǎng)血、固攝沖任以安胎?，F(xiàn)代研究[12]發(fā)現(xiàn)壽胎丸方中桑寄生、續(xù)斷可抑制子宮平滑肌收縮，菟絲子能產(chǎn)生類似于黃體酮及人絨毛膜促性腺激素的作用，阿膠通過降低細(xì)胞因子的表達(dá)可調(diào)節(jié)母胎界面免疫紊亂狀態(tài)，共同起到維持妊娠作用。雖然近年來大量研究顯示壽胎丸的作用機(jī)制可能為通過調(diào)節(jié)某些相關(guān)細(xì)胞因子及蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)，但壽胎丸治療RSA的確切作用靶點(diǎn)及具體功能通路尚未有深入系統(tǒng)的研究。

該研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對壽胎丸治療RSA的作用機(jī)制做初步系統(tǒng)探討。研究共篩選出壽胎丸21種主要活性化學(xué)成分，篩選出與RSA相關(guān)的108個靶點(diǎn)。通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建的藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖中可看出，一個化學(xué)成分可作用于多個靶點(diǎn)，同時多個化學(xué)成分也可作用于一個靶點(diǎn)，共同構(gòu)成了錯綜復(fù)雜的多邊網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中一條邊連接2個節(jié)點(diǎn)代表二者存在相互作用關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)中與每個節(jié)點(diǎn)相連的全部線條的總數(shù)稱為該節(jié)點(diǎn)的連接度—Degree，每個節(jié)點(diǎn)的Degree代表其對應(yīng)的化學(xué)成分和靶點(diǎn)的重要性，且重要程度與Degree成正比。通過分析顯示發(fā)揮關(guān)鍵作用的化合物包括Quercetin（槲皮素）、Kaempferol（山柰酚）、Beta-Sitosterol（Β-谷甾醇）、Isorhamnetin（異鼠李素）、Matrine（苦參堿）等。槲皮素是桑寄生和菟絲子的主要有效成分，它是一種多羥基黃酮類化合物，其具有抗氧化及清楚自由基、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降糖、降脂、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性和廣泛的藥理學(xué)作用，在治療細(xì)菌感染、病毒感染、腫瘤、糖尿病、高血脂和免疫系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要作用[13]。山柰酚存在于菟絲子中，也是一種黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抑制蛋白激酶等作用，可用于防治糖尿病、動脈粥樣硬化和骨質(zhì)疏松，保護(hù)神經(jīng)、肝臟和心肌等[14]。β-谷甾醇是續(xù)斷、菟絲子的活性成分，主要有降血脂，抗炎，抗腫瘤的藥理活性，還可調(diào)節(jié)骨代謝平衡、保護(hù)胃黏膜，而且對脂質(zhì)體具有很好的抗氧化活性[15]。異鼠李素為菟絲子的有效成分，同樣是一種黃酮類化合物，研究發(fā)現(xiàn)其具有內(nèi)皮保護(hù)、抗動脈粥樣硬化、抗心肌缺血、保護(hù)心肌細(xì)胞、抑制心肌纖維化、降血壓、抗血栓及血小板凝集、抗氧化等多種作用可保護(hù)心腦血管，此外其作用還涉及抗炎，抗病毒，抗腫瘤，降糖，耐缺氧，抑制脂肪細(xì)胞分化等多個方面[16]?？鄥A存在于菟絲子中，主要藥理活性有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等，另外可解熱、鎮(zhèn)痛、抗驚厥、穩(wěn)定神經(jīng)，對防治動脈粥樣硬化、減輕心肌損傷、抗肝損傷、抗纖維化有效果[17]。

通過STRING平臺對藥物與疾病共同靶點(diǎn)108個基因進(jìn)行分析，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)JUN、AKT1、MAPK1、IL6、ESR1、FOS、MAPK14、MAPK8、EGFR、VEGFA等基因?yàn)閴厶ネ柚委烺SA的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，說明壽胎丸很可能是通過作用于這些靶點(diǎn)以發(fā)揮其藥理作用。JUN為1號染色體的原癌基因，編碼一種與病毒蛋白高度相似的蛋白，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。研究[18-19]證實(shí)JUN主要參與MAPK的JNK及JAK-STAT等信號通路，影響受精卵向囊胚發(fā)育的速率、滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和血管重鑄。AKT1是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，是AKT家族一員，參與調(diào)控細(xì)胞增殖和生長，參與代謝、增殖、細(xì)胞成活、生長、胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及血管生成等多種生物學(xué)過程。AKT作為PI3K途徑的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，有研究[20]表明活化的AKT能改善蛻膜組織血管重建，通過改善RSA母胎界面血管生成以降低胚胎丟失率。MAPK1、MAPK14、MAPK8均屬于絲裂原活化蛋白激酶，也是一組絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，是連接細(xì)胞表面到細(xì)胞核內(nèi)部的重要信息傳遞者，參與細(xì)胞增殖、生長、分化、癌變、轉(zhuǎn)移、凋亡等生理病理過程。MAPK作為MAPK通路的重要組成部分，能夠協(xié)調(diào)多種蛋白的表達(dá)，改善子宮內(nèi)膜容受性，通過調(diào)控胚胎細(xì)胞骨架影響囊胚正常成腔發(fā)育，對于胚胎植入和發(fā)育起到重要調(diào)控作用[21-22]。

對靶基因進(jìn)行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)壽胎丸治療RSA主要通過影響細(xì)胞因子活性及功能、蛋白表達(dá)、基因轉(zhuǎn)錄等發(fā)揮關(guān)鍵作用。進(jìn)行KEGG通路富集分析后發(fā)現(xiàn)，壽胎丸活性成分相關(guān)靶點(diǎn)作用于RSA的主要參與通路涉及AGE-RAGE Signaling Pathway in Diabetic Complications、Fluid Shear Stress and Atherosclerosis、Hepatitis B、Proteoglycans in Cancer、PI3K-AKT Signaling Pathway等，每條通路涉及多個基因靶點(diǎn)。通路上所含靶點(diǎn)數(shù)提示了藥物通過該通路發(fā)揮作用的重要程度，其中基因數(shù)目最多的通路為糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路，含有26個靶點(diǎn)基因。該通路中涉及TGF-β、PI3K/AKT、MAPK、JAK-STAT等多個通路。TGF-β信號通路是一個含有多種類、多功能細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)，在細(xì)胞增殖與分化、胚胎的形成與發(fā)育、組織和器官的形成與修復(fù)以及免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮著重要的作用[23]。其中，TGF-β1是目前研究最多的調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入過程的細(xì)胞因子，它廣泛表達(dá)于妊娠組織中，在胚胎著床、促進(jìn)胚胎發(fā)育、誘導(dǎo)母胎之間免疫耐受及維持妊娠等方面發(fā)揮重要作用[24]。近年來，有研究表明PI3K/AKT信號通路參與調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化發(fā)育，在胚胎生長、發(fā)育和血管生成調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用[25]。MAPK通路參與滋養(yǎng)細(xì)胞功能的調(diào)控及免疫調(diào)節(jié)，從而與RSA密切相關(guān)。李維宏等[26]研究表明，URSA患者p38MAPK信號通路較正常妊娠患者為低表達(dá)，通過激活URSA患者p38MAPK信號通路改善Treg/Th17平衡可保護(hù)妊娠。JAK/STAT信號通路是一條主要由細(xì)胞因子激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對細(xì)胞的增殖分化、胚胎發(fā)育及免疫功能調(diào)節(jié)等起到關(guān)鍵作用。STAT家族為JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子，參與胚胎植入及維持胚胎正常發(fā)育等多項(xiàng)生物學(xué)功能[27-28]。總之，壽胎丸通過調(diào)節(jié)血管生成、免疫功能、細(xì)胞生長及子宮內(nèi)膜容受性等方面發(fā)揮保護(hù)妊娠作用。

將小分子與靶點(diǎn)蛋白的活性口袋進(jìn)行對接，其結(jié)合能反應(yīng)分子與靶點(diǎn)之間結(jié)合的難易度，二者親和力越高結(jié)合釋放的能量越低，構(gòu)象越穩(wěn)定。結(jié)合能（affinity）>4.25 kcal/mol表示分子與靶點(diǎn)蛋白之間有一定的結(jié)合活性;結(jié)合能>5.0 kcal/mol表明二者之間有較好的結(jié)合活性;結(jié)合能>7.0 kcal/mol則表結(jié)合活性很強(qiáng)[29]。分子對接表明Quercetin，Kaempferol，Beta-Sitosterol，Isorhamnetin，Matrine，NSC63551等活性成分與AKT1、EGFR、ESR1、FOS、IL6、JUN、MAPK8、VEGFA等潛在靶點(diǎn)大多有良好的結(jié)合能力。其中結(jié)合最好的為分子MOL000184（NSC63551）和蛋白AKT1，形成的氫鍵相互作用是二者之間最主要的作用力。所有的這些相互作用使得配體分子MOL000184和受體蛋白AKT1形成穩(wěn)定的復(fù)合物?？傊?，上述的分子對接研究對分子MOL000184和靶點(diǎn)蛋白AKT1的相互作用給予了合理的解釋。經(jīng)過分子對接驗(yàn)證，我們可以認(rèn)為MOL000184是壽胎丸中重要的有效成分，蛋白AKT1是壽胎丸治療RSA的核心作用靶點(diǎn)，壽胎丸的主要活性成分與作用于RSA的靶點(diǎn)具有一定甚至強(qiáng)烈的結(jié)合能力，驗(yàn)證了壽胎丸治療RSA分子層面的可能性及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究其治療機(jī)制的可靠性。

該研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)研究壽胎丸治療RSA的可能作用機(jī)制，初步揭示了壽胎丸通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路對RSA的整體調(diào)節(jié)作用。但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的局限性，后續(xù)須對其作用機(jī)制做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證研究，為臨床提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。

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（2020-11-02收稿?責(zé)任編輯：魏慶雙）