苗衛(wèi)東 王萌 高換超 井朋偉 李少東 樊秀彩

摘要：利用葉面噴施方法，探討100 μmol/L外施褪黑素（MEL）溶液對低溫脅迫下不同葡萄品種抗氧化酶系統(tǒng)和抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)（AsA-GSH循環(huán)）的影響，以此推論MEL在葡萄受到低溫脅迫時起到的作用。結果表明，外源MEL可以促進低溫脅迫下葡萄抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）含量的積累，降低GSSG含量。長時間（7 h）低溫脅迫下，外源MEL可以降低脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）含量，能夠維持較高的AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中抗壞血酸過氧化物酶（APX）、DHAR、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）、谷胱甘肽還原酶（GR）活性。噴施外源MEL促進了低溫脅迫下葡萄AsA-GSH循環(huán)快速而有效的運轉，降低了低溫脅迫對葡萄植株的氧化傷害，從而緩解了低溫脅迫對葡萄幼苗的傷害作用。

關鍵詞：葡萄;低溫脅迫;外源褪黑素;酶活性;抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán);抗氧化酶

中圖分類號： S663.101? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）23-0133-06

收稿日期：2021-08-06

作者簡介：苗衛(wèi)東（1968—），男，河南遂平人，副教授，主要從事園藝植物栽培生理研究。E-mail：wangmeng991226@163.com。

通信作者：樊秀彩，碩士，研究員，主要從事葡萄遺傳資源研究。E-mail：fanxiucai@caas.cn。

葡萄（Vitis vinifera L.）是我國及世界上的重要水果之一，但在葡萄栽培生產過程中常常遭遇低溫脅迫。低溫常常引起植物生理代謝紊亂，生長發(fā)育受到抑制，降低產量和品質。目前對低溫脅迫的研究主要集中在膜傷害、光合、滲透調節(jié)物質、抗氧化酶活性等方面[1]。褪黑素（melatonin，簡稱MEL）是一種生物調節(jié)劑，它不僅在植物的正常生長和發(fā)育過程中扮演著必不可少的角色，而且它還可以通過提高抗氧化酶活性，降低活性氧（ROS）含量，提高植株抗性，以此緩解多種環(huán)境脅迫，如抗寒、干旱、鹽漬、營養(yǎng)元素缺乏等[2-3]。

近年來，MEL介導植物對生物和非生物脅迫下的抗性研究越來越受到人們關注，已有研究表明，適宜濃度的MEL處理可以提高植物對低溫的忍耐性，但效果卻因MEL處理的濃度、逆境類型及植物種類而異?？箟难?谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)系統(tǒng)是植物體內清除活性氧自由基的重要途徑，但關于MEL是否參與調節(jié)低溫脅迫下葡萄體內 ASA-GSH 循環(huán)，緩解低溫脅迫對葡萄植株的氧化傷害研究報道較少[4-5]。本試驗選取砧木品種SO4葡萄（SO4 grape）、紅提葡萄（Red Globe grape）和無核白葡萄（Thompson Seedless grape）3個葡萄品種的一年生盆栽自根苗為試驗材料，研究外源MEL對低溫脅迫下葡萄AsA-GSH循環(huán)的影響，為進一步研究外源MEL對葡萄植株抗低溫脅迫能力的影響、MEL緩解低溫傷害等方面提供一定的理論依據(jù)，為葡萄防寒管理提供一定的理論依據(jù)和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料采集于河南科技學院葡萄種質資源圃（試驗地點：35°16′ 56″N，113°55′ 49″E;試驗時間：2021年3—9月）。以SO4葡萄、紅提葡萄、無核白葡萄3個葡萄品種的一年生自根苗為試驗材料，采用盆栽方式，盆口直徑為30 cm、高為25 cm。每盆裝沙壤土4.0 kg。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

盆栽苗長勢良好后進行試驗處理，每個品種隨機選取10盆，每盆種植1株一年生自根苗，首先進行低溫脅迫處理試驗（-15 ℃），常溫溫度為25 ℃，24 h后取材測定各項指標，每個處理重復3次;然后09：00—10：00時采用100 μmol/L外施褪黑素（MEL）溶液進行葉面噴施，MEL溶液里添加0.5% Tween-20增加表面附著。葉面噴施 3 d 后，測定各項指標。試驗設計4個處理：（1）對照，噴施清水后進行常溫處理;（2）低溫，噴施清水后進行低溫處理，處理1、4、7、11、24 h;（3）MEL，常溫的噴施MEL;（4）低溫+MEL，低溫處理的噴施MEL。從每個處理的植株中上部選取葉片3張，所采樣品生長勢及管理水平一致。

1.2.2 抗氧化酶系統(tǒng)中抗氧化酶活性的測定

超氧化物歧化酶（SOD）活性采用SOD抑制氮藍四唑（NBT）光化還原法進行測定，過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法進行測定，過氧化氫酶（CAT）活性采用高錳酸鉀滴定法進行測定[6]。以上生理指標均采用北京索萊寶科技發(fā)展公司試劑盒進行測定，型號分別為BC0700、PR1400、BC1340，每個指標類型重復測定3次。

1.2.3 AsA-GSH循環(huán)代謝物指標的測定

還原型抗壞血酸（AsA）、氧化型抗壞血酸（dehydroascorbic acid，簡稱DHA）含量的測定采用二聯(lián)吡啶法[7]。氧化型谷胱甘肽（GSSG）、還原型谷胱甘肽（GSH）含量的測定采用Nagalakshmi等的DTNB檢測法[8]?？箟难徇^氧化物酶（APX）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）以及谷胱甘肽還原酶（GR）活性的測定參考Nakano等的方法[9]，單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）活性的測定參考Krivosheeva等的方法[10]。以上生理指標均采用北京索萊寶科技有限公司試劑盒進行測定，型號分別為BC1170、BC1160、BC0195、BC0650、BC1230、BC1180，每個指標類型重復測定3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 褪黑素對低溫脅迫下不同葡萄品種抗氧化酶活性的影響

2.1.1 低溫脅迫下不同葡萄品種抗氧化酶活性的變化

由表1可知，低溫脅迫處理后，3個葡萄品種的SOD和CAT依然保持較高的酶活性，這可能是SOD和CAT保護酶活性的耐寒機制已形成，當處理7 h時，酶活性達到最高，與常溫相比差異極顯著（P<0.01），這是低溫的一種適應性反應，使其比在常溫下能更有效地清除體內的有毒物質，保護葡萄植株免受傷害或減少傷害。當?shù)蜏孛{迫7 h時，砧木SO4葡萄的SOD和CAT活性最高，分別達到（5.83±0.002 65） U/g鮮質量（FW）和（65.20±0.072 1） U/g 鮮質量。但到7 h后，3個葡萄品種的SOD和CAT活性均開始隨著處理時間的增加呈下降趨勢，說明隨著低溫處理時間的延長，葡萄植株有受凍害的可能，因此在葡萄栽植管理過程中，遇到低溫脅迫時，葡萄品種、溫度和時間都是必須要考慮的因素。隨著低溫脅迫時間的增加，3個葡萄品種的POD活性均呈逐漸下降的趨勢，低溫處理24 h，SO4葡萄的POD活性降低到（70.00±1.100 0） U/g FW，紅提葡萄的POD活性為（46.67±0.115 3） U/g FW，無核白葡萄的POD活性僅為（41.67±0.085 4） U/g FW。說明隨著低溫脅迫時間的延長，抗氧化酶的活性受到破壞，葡萄植株受到低溫傷害。

2.1.2 褪黑素對低溫脅迫下不同葡萄品種抗氧化酶活性的影響

由表2可知，在1～24 h低溫脅迫時間內，噴施外源MEL，3個葡萄品種SOD和CAT活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在7 h時酶活性達到最高，與常溫相比差異極顯著（P<0.05）;POD活性呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。在低溫脅迫的整個過程中，噴施外源MEL顯著提高了SOD和CAT活性。噴施外源MEL降低了低溫脅迫下的POD活性，說明噴施外源MEL在低溫脅迫下可以提高葡萄SOD和CAT活性，抑制POD活性，說明噴施外源MEL可以增加葡萄植株體內抗氧化物酶活性，間接增加了抗氧化物質的含量，能有效地清除體內的自由基，提高葡萄植株抵抗低溫脅迫的能力。

2.2 褪黑素對低溫脅迫下不同葡萄品種AsA-GSH循環(huán)途徑的影響

2.2.1 低溫脅迫下不同葡萄品種AsA-GSH循環(huán)中酶活性和代謝物的變化

在抗壞血酸代謝中，APX以AsA作為電子供體，催化AsA與H2O2反應，達到分解H2O2的目的;MDHAR以還原型輔酶II（NADPH）作為電子供體，將單脫氫抗壞血酸（MDHA）還原為AsA;脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）在堿性條件下催化GSH使脫氫抗壞血酸還原酶（DHA）還原為AsA;谷胱甘肽還原酶（GR）是一種黃素蛋白氧化還原酶，能催化GSSG還原為GSH，從而使細胞內的谷胱甘肽庫保持在還原狀態(tài)。

由表3可知，低溫脅迫過程中，隨著處理時間的延長，3個葡萄品種APX、GR、DHAR和MDHAR活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，而且低溫7 h時極顯著高于常溫水平。低溫處理7 h時，SO4葡萄中GR、DHAR和MDHAR活性分別達到（6.27±0.010 0） μmol/g、（10.86±0.020 0） μmol/g 和（6.27±0.026 3） μmol/g，而APX活性在紅提葡萄中達到（18.48±0.050 0） U/g FW，是3個葡萄品種中APX活性最高的。值得注意的是，SO4葡萄中MDHAR活性在低溫處理 4 h 時達到峰值，這比紅提葡萄和無核白葡萄中MDHAR活性峰值提早3 h。結果表明，3個葡萄品種在抵抗低溫脅迫過程中AsA-GSH循環(huán)中各種酶活性明顯增加，且SO4葡萄的增加幅度更大。但超過7 h低溫脅迫后，3個不同葡萄品種APX、GR、DHAR和MDHAR活性開始出現(xiàn)下降，說明低溫脅迫一定時間內，葡萄自身會啟動體內AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中的酶活性，提高防御能力，但是隨著低溫脅迫時間的延長，這種能力會下降，AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中APX、GR、DHAR和MDHAR活性下降。

低溫脅迫期間3個葡萄品種的AsA和GSH含量及GSH/GSSG比值的變化與酶活性變化一致，均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，而氧化型谷胱甘肽含量則為逐漸下降趨勢，低溫處理24 h后，SO4葡萄、紅提葡萄和無核白葡萄分別降低到（4.03±0.034 6） mmol/g FW、（2.21±0.030 0） mmol/g FW和（2.05±0.020 0） mmol/g FW。3個葡萄品種的AsA和GSH含量在低溫脅迫7 h時達到最大值，與對照相比差異極顯著。3個葡萄品種中SO4葡萄的AsA含量、GSH含量以及GSH/GSSG值最高，分別達到（3.13±0.034 6） mmol/g FW、（4.27±0.052 9） mmol/g FW和57.74%;其次為紅提葡萄，該品種的AsA含量、GSH含量以及GSH/GSSG值分別為（2.89±0.0557） mmol/g FW、（1.21±0.036 1） mmol/g FW和45.66%;無核白葡萄的AsA含量、GSH含量以及GSH/GSSG值最低，依此為（1.55±0.0346）mmol/g FW、（1.01±0.036 1） mmol/g FW和39.15%。說明低溫脅迫期7 h之前，3個葡萄品種中的AsA含量和GSH含量增加，GSSG含量降低，促使AsA最大程度地保持在還原狀態(tài)，有利于增強葡萄幼苗抵抗低溫脅迫的能力，而隨著低溫脅迫時間的延長，AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中APX、GR、DHAR和MDHAR活性降低，GSH含量和GSSG含量降低，促使AsA含量下降，葡萄會受到低溫傷害。

2.2.2 褪黑素對低溫脅迫下不同葡萄品種AsA-GSH循環(huán)途徑的影響

GR、DHAR、MDHAR對維持AsA-GSH循環(huán)的有效運行具有重要的作用。由表4可知，低溫脅迫下噴施外源MEL，APX、GR、DHAR和MDHAR活性在7 h前逐漸增加，隨后快速下降。低溫脅迫1～11 h時噴施外源MEL，APX、GR、DHAR、MDHAR活性顯著高于常溫。噴施外源MEL在低溫脅迫7 h時，SO4葡萄中DHAR和MDHAR活性均高于紅提葡萄和無核白葡萄，分別達到（12.11±0.040 0） 、（8.50±0.043 6） μmol/g;而APX和GR活性在紅提葡萄中最高，分別達到（29.33±0.045 8） U/g FW和（8.93±0.026 5） μmol/g。說明施用外源MEL能保持相對較高的APX、MDHAR、DHAR和GR活性，增強植株對H2O2等活性氧的清除能力。

GSH不僅是一種抗氧化物質，而且是脫氫抗壞血酸還原酶（DHA）的電子供體，能清除生物體內的自由基從而解除毒害，它通過AsA-GSH循環(huán)可加快AsA再生[1]。在低溫脅迫時噴施外源MEL處理期間，3個葡萄品種中AsA含量、GSH含量、GSSG含量和GSH/GSSG值的變化均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢。低溫脅迫中噴施外源MEL增加了AsA、GSH、GSSG含量，其中低溫脅迫7 h時施加外源MEL，AsA、GSH、GSSG含量和GSH/GSSG值達到最大，與對照相比，效果差異極顯著（P<0.01）。3個葡萄品種中SO4葡萄的AsA、GSH、GSSG含量及GSH/GSSG值最高，分別達到（4.67±0.062 4）、（5.67±0.026 5）、（9.16±0.045 8） mmol/g FW和61.90%;其次為紅提葡萄，該品種AsA、GSH、GSSG含量以及GSH/GSSG值分別為（3.99±0.020 0）、（2.33±0.036 1）、（4.67±0.045 8） mmol/g FW和49.89%;而無核白葡萄的AsA、GSH、GSSG含量以及GSH/GSSG值是3個品種中最低的，僅為（3.00±0.026 5）、（1.79±0.026 5）、（4.33±0.010 0） mmol/g FW和41.34%?？梢?，低溫脅迫下噴施適量MEL可顯著提高GSH含量，降低GSSH含量，導致GSH/GSSG的比值明顯提高。說明噴施外源褪黑素可通過提高AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的代謝活動，減輕活性氧對葡萄幼苗的傷害，從而提高葡萄抵抗低溫脅迫的能力。

3 討論與結論

低溫脅迫會影響植物的光合作用和能量的產生，導致物質合成受阻，細胞內活性氧積累，代謝失衡從而引發(fā)膜脂過氧化、電解質失衡、細胞代謝紊亂等[2，11]，嚴重時會導致植物死亡。面對脅迫植物可以調動自身的抗氧化防御機制，產生SOD、CAT、POD、APX、GR、DHAR、MDHAR等抗氧化酶以及AsA、GSH等抗氧化劑[7-10]，通過直接或間接途徑還原積累的活性氧[9]，從而減少低溫對植物造成的傷害。

本試驗主要探究低溫脅迫下外源施用MEL對不同葡萄品種常規(guī)抗氧化酶及AsA-GSH循環(huán)代謝系統(tǒng)的影響，結果發(fā)現(xiàn)低溫處理的3種葡萄，SOD、CAT、POD活性隨處理時間的延長均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，這與鄭春芳等的研究結果[5]一致。這可能是由于在脅迫初期，低溫作為信號，啟動了植物的應激反應，而在脅迫后期低溫降低了抗氧化酶活性，大量積累的活性氧誘導丙二醛（MDA）等有毒代謝物質大量產生，進而抑制了保護酶的活性。噴施外源MEL的葡萄，遭受低溫脅迫后SOD、CAT、POD活性與未噴施MEL的處理相比也呈現(xiàn)相同的趨勢，但是酶活性均高于低溫處理植株，這也在其他研究[12-15]中被證明，說明施用外源MEL可以提高SOD、POD、CAT這些常規(guī)抗氧化酶的活性，通過減少細胞膜脂過氧化，保持細胞膜完整性進而有效降低低溫對葡萄植株造成的傷害。

AsA和GSH可以維持蛋白質的穩(wěn)定性，生物膜系統(tǒng)結構的完整性及防御膜脂過氧化，與APX、DHAR、MDHAR、GR共同構成了能有效清除自由基的循環(huán)系統(tǒng)，即AsA-GSH循環(huán)，在抗氧化機制中發(fā)揮重要作用，在AsA-GSH循環(huán)中AsA借助APX的催化作用與H2O2反應，接受來自GSH的NADPH，把H2O2還原成H2O，同時自身被氧化形成MDHA，一部分的MDHA則在MDHAR的作用下被還原為AsA，重新參與AsA-GSH循環(huán)，而另一部分的MDHA通過再次氧化形成DHA，DHA又以GSH為底物在DHAR催化作用下重新生成AsA，而此反應所產生的GSSG在NADPH參與下又被GR催化還原成GSH[16-21]。在本試驗中，低溫脅迫初期，AsA-GSH系統(tǒng)中的抗氧化酶活性及非酶抗氧化劑含量呈上升趨勢，脅迫后期整體又呈下降的趨勢，呈現(xiàn)這種趨勢的原因推測與SOD、CAT、POD活性變化規(guī)律相同。而施用100 μmol/L外源MEL，APX、DHAR、MDHAR、GR活性和AsA、GSH含量提高，GSH/GSSG比值提升，說明施用外源MEL提高了AsA和GSH含量，為AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)提供了充足底物，加速了活性氧清除效率，減輕了活性氧對膜脂的傷害，保持了細胞完整性，從而緩解了低溫對葡萄的傷害，為葡萄防寒管理提供一定的理論依據(jù)和技術指導。

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