吳硯農(nóng)，鄭偉尉，陸偉杰，臧運祥

（浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院 浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 311300）

十字花科Brassicaceae植物多為1年生或多年生的草本植物，包含小白菜Brassica rapassp.chinensis、甘藍Brassica oleraceavar.capitata、油菜Brassica napus、蘿卜Raphanus sativus等蔬菜作物，還有二月蘭Orychophragmus violaceus等觀賞植物，以及板藍根Isatis tinctoria等藥用植物等。十字花科植物中富含葉綠素，且葉與莖中的葉綠素遠高于其他色素，因此外觀上呈現(xiàn)綠色，但在彩葉植物或者葉綠素缺失植物中，由于其他色素大幅增加或葉綠素大幅減少而呈現(xiàn)彩色或黃色等。植物中存在著數(shù)量巨大的各類突變體，常作為研究植物生理生化機制與基因組功能的重要材料[1-3]。其中一類葉綠素缺失，植株表型黃化的突變體，稱為黃化突變體[4-5]。由于黃化性狀易觀察，可以直觀呈現(xiàn)植物體內(nèi)葉綠素的多寡，且影響植物光合作用及生長發(fā)育，因此黃化突變體是研究葉綠素合成代謝的優(yōu)良材料。本研究對十字花科植物中發(fā)現(xiàn)的黃化突變進行分類，總結(jié)黃化突變體形態(tài)結(jié)構(gòu)及光合色素含量的變化規(guī)律，探求黃化形成原因與分子機制，歸納黃化性狀遺傳模式，為十字花科植物的葉綠素代謝及葉綠體發(fā)育等研究提供參考。

1 黃化突變類型及其外觀特征

1.1 黃化突變類型

1.1.1 葉綠素缺失黃化突變 十字花科植物中已發(fā)現(xiàn)多個葉綠素缺失導(dǎo)致的黃化突變體。小白菜自交系‘564’和品種‘寒青’‘Hanqing’、‘華冠’‘Huaguan’中均發(fā)現(xiàn)黃化突變體[6-8]。楊沖等[9]從意大利引進的甘藍雜交種Hosom自交分離后代中發(fā)現(xiàn)葉色黃化、植株矮小的突變體YL-1。杜江濤[10]和侯愛琳[11]對大白菜Brassica rapassp.pekinensisDH系‘FT’進行甲基磺酸乙酯(EMS)誘變，分別獲得了穩(wěn)定的黃化突變體lcm2、lcm3。通過自發(fā)突變、EMS誘變、氮離子束處理等方式，甘藍型油菜中也獲得了多個黃化突變體，如ny、bnaC.ygl等[12-15]。楊勝洪等[16]發(fā)現(xiàn)：抽薹期的油菜黃化突變體葉片的葉綠素含量和葉綠素與蛋白質(zhì)比值只有野生型的一半。此外，F(xiàn)RICK等[17]發(fā)現(xiàn)：擬南芥Arabidopsis thaliana的porB-1porC-1雙突變體在子葉期只含有少量的葉綠素a，形成了一個幼苗致死的黃色表型。

通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)也可獲得黃化突變體。BANG等[18]研究發(fā)現(xiàn)：擬南芥CHL27-T敲除突變體生長遲緩，并且伴隨著由葉綠體光系統(tǒng)Ⅱ的反應(yīng)中心損壞引起的發(fā)育缺陷。PRIVAT等[19]發(fā)現(xiàn)：反義表達質(zhì)體SIG2轉(zhuǎn)錄因子的擬南芥植物表現(xiàn)出葉綠素缺失的表征，并且只表現(xiàn)在子葉中。KUMAR等[20]通過反義表達HEMA基因，獲得了表現(xiàn)出不同程度葉綠素缺失性狀的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，如葉片斑塊狀黃化和全株黃化。以上研究表明：黃化突變表現(xiàn)為植株全株黃化或部分黃化，且黃化性狀可穩(wěn)定遺傳。

1.1.2 葉綠素缺失白化突變 葉綠素是植物生長必不可少的光合色素，如果葉綠素缺失突變導(dǎo)致葉綠素完全不可合成，或葉綠素含量無法保證植株最低程度的光合作用，植株表現(xiàn)出白化，則易發(fā)生致死性突變。KOBAYASHI等[21]報道了1種類囊體膜脂質(zhì)單氨基半乳糖二酰甘油(MGDG)合成酶1完全缺陷的擬南芥突變體，只在蔗糖存在的情況下才能萌發(fā)為細小的白化植株，且幼苗缺乏半乳糖，光合膜被破壞，光合能力受損嚴重。擬南芥白化突變體cfl1的真葉有白色壞死斑點，葉片發(fā)育畸形且不對稱，葉邊緣缺刻嚴重，生長緩慢，植株矮小，結(jié)實率低[22]。白化突變植株與黃化突變植株相比，葉綠素缺失更為嚴重，植株生長受到的影響也更大，甚至導(dǎo)致植株無法存活。

1.1.3 黃化復(fù)綠突變 在目前發(fā)現(xiàn)的黃化突變體中，部分黃化突變體在生長過程中黃化性狀減弱，植株隨時間延長逐漸復(fù)綠。郭士偉等[7]發(fā)現(xiàn)小白菜黃化突變體在6葉齡前子葉和真葉均呈淡黃色，在6葉齡后又逐漸復(fù)綠，且不受環(huán)境影響。甘藍型油菜黃化突變體ny在苗期前期葉片黃化明顯，其后葉色緩慢轉(zhuǎn)變，中后期及衰老期葉片復(fù)綠[23]。黃化突變體復(fù)綠原因現(xiàn)在還未完全探明，需要進一步深入研究。

1.2 黃化突變體表型

多數(shù)黃化突變體表現(xiàn)出營養(yǎng)生長緩慢，生殖發(fā)育遲緩等現(xiàn)象。擬南芥CHL27敲除后的黃化突變體植株矮小，葉片均勻呈淺綠色，蓮座葉彎曲，開花較晚，角果彎曲[18]；lzf1突變體幼苗葉綠體發(fā)育延遲[24]。青梗菜是小白菜中一類束腰亮綠的優(yōu)質(zhì)品種，其564y突變體播種后5 d出現(xiàn)葉色差異，葉片黃化，下胚軸伸長，伴隨植株細弱易倒，大部分生長指標明顯低于野生型[6]。在甘藍型油菜和芥菜Brassica juncea型油菜中發(fā)現(xiàn)的黃化突變體性狀表現(xiàn)相似，均出現(xiàn)初花期推遲，花期較短等特點[8,25]。甘藍黃化突變體yl-1，雖然仍能結(jié)球，但單球質(zhì)量只有對照的39.0%[9]。甘藍型油菜黃化突變體Bnchd1，苗期葉脈間黃化，抽薹期薹葉呈淡綠色，整個生命周期內(nèi)植株矮化，葉綠體形態(tài)異常并伴隨著葉綠素提早降解現(xiàn)象，種子產(chǎn)量極低[12]。這些研究表明：黃化突變后植株的生長及發(fā)育階段轉(zhuǎn)變都受到不同程度的影響。

2 黃化突變體中葉綠體特性及光合性能

2.1 黃化突變?nèi)~綠體超微結(jié)構(gòu)變化

葉綠體由被膜、類囊體和基質(zhì)3部分構(gòu)成，若葉綠體的類囊體受到破壞，植物的光合作用及其他生理過程都會受到不同程度的影響。多數(shù)黃化突變體具有類囊體結(jié)構(gòu)變異和基粒片層數(shù)減少等特征[26]。擬南芥FZL基因敲除突變體中類囊體形態(tài)異常，基粒堆疊雜亂，基粒和基質(zhì)類囊體的相對比例發(fā)生改變[27]。煙草Nicotiana tabacum黃化突變體中葉綠體體積變小，數(shù)目減少并缺乏大部分類囊體膜，部分葉綠體表現(xiàn)出雙重形態(tài)[28]。甘藍型油菜的bnaC.ygl突變體與正常植株T6的葉綠體形狀都呈正常紡錘狀，但突變體葉綠體的基粒垛疊較少，類囊體膜也明顯減少[14]。部分黃化突變體葉綠體中的嗜鋨顆粒及淀粉粒含量也會發(fā)生變化。青梗菜564y突變體中葉綠體垛疊數(shù)明顯變少，基粒片層結(jié)構(gòu)難以觀測，葉綠體淀粉粒數(shù)目較多[6]。甘藍型油菜黃化突變體中，葉綠體的數(shù)量、形狀、膜結(jié)構(gòu)均受影響，且類囊體缺失，葉綠體內(nèi)無淀粉粒，嗜鋨顆粒較多，而復(fù)綠的葉片細胞內(nèi)則與正常葉片表現(xiàn)相近[13]，甘藍型油菜突變體cr3529中也有類似特征[26]。吳硯農(nóng)[29]對小白菜黃化突變體BcL14y-1和BcL14y-2研究發(fā)現(xiàn)：BcL14y-1黃化程度較輕，其葉綠體內(nèi)類囊體垛疊數(shù)量有所減少，BcL14y-2黃化程度較重，葉綠體形狀不規(guī)則，除類囊體垛疊數(shù)大量減少外，基粒片層排列混亂，嗜鋨顆粒聚集，有過量淀粉粒囤積。擬南芥arc突變體的每個葉肉細胞只有2～15個較大的葉綠體，雖然葉綠體個數(shù)減少，但作為補償，單個質(zhì)體體積增大，從而保持葉肉細胞體積恒定[30]。OKAZAKI等[31]研究發(fā)現(xiàn)：擬南芥過表達質(zhì)體分裂蛋白(plastid division proteins，PDV)后，葉綠體數(shù)量增加但體積減小，而PDV表達水平降低則出現(xiàn)相反結(jié)果。正常綠色植物的葉綠體成紡錘狀緊貼細胞壁，基粒垛疊數(shù)較多且片層結(jié)構(gòu)規(guī)整，有少量淀粉粒和嗜鋨顆粒分布，而黃化突變植株的葉綠體則會出現(xiàn)不同程度的變異，導(dǎo)致這些變異的原因及分子機制需要進一步深入研究。

2.2 黃化突變體內(nèi)光合色素

多數(shù)表現(xiàn)出黃化性狀的突變體中，葉綠素含量顯著低于野生型，而類胡蘿卜素發(fā)揮了主導(dǎo)作用，因此葉片呈現(xiàn)出黃色表型。葉綠素包括葉綠素a和葉綠素b，在不同的黃化突變體中，兩者質(zhì)量下降幅度有所不同。陳艷麗[14]發(fā)現(xiàn)甘藍型油菜黃化突變體bnaC.ygl中，葉綠素a和葉綠素b的質(zhì)量分數(shù)分別下降了40.3%和57.7%，葉綠素a/b相較非突變品系T6顯著提高，在其他不同的芥菜型油菜黃化突變體和甘藍型油菜黃化突變體中也有類似表現(xiàn)[9,18,22-23]。在青梗菜黃化突變體pylm中，葉綠素a、葉綠素b質(zhì)量分數(shù)分別下降了62.0%和75.0%，類胡蘿卜素質(zhì)量分數(shù)也下降了58.0%[8]，葉片中的血紅素顯著上升[32]。大白菜黃化突變體lcm2的葉綠素a、葉綠素b質(zhì)量分數(shù)分別下降了60.25%和70.91%[10]，而lcm3的葉綠素a、葉綠素b質(zhì)量分數(shù)則分別降低了33.0%和53.0%[11]。從前人研究結(jié)果可以看出：在各類黃化突變體中，葉綠素a和葉綠素b顯著下降，尤其是葉綠素b，因此，葉綠素a和葉綠素b在光系統(tǒng)反應(yīng)中的功能差異及其機制值得進一步研究。

2.3 黃化突變體光合性能

光合作用的能力強弱與植物的生長發(fā)育及生殖階段轉(zhuǎn)變有關(guān)。在逆境條件下，葉綠素?zé)晒鈪?shù)也是衡量光合能力的重要指標[33]，黃化突變通常缺失葉綠素，意味著光合能力降低。與野生型相比，青梗菜564y黃化突變體凈光合速率顯著降低，氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率稍低，胞間二氧化碳摩爾分數(shù)稍高，同時各項熒光動力學(xué)參數(shù)均降低[6]。油菜黃化突變體ny五葉期的凈光合速率，心葉僅為野生型的57.96%，平展葉也只有69.62%，同時各項熒光參數(shù)顯著低于野生型[23]。甘藍黃化突變體yl-1在苗期時，凈光合速率顯著低于野生型，而隨著植株生長，突變體逐漸恢復(fù)部分光合能力，但仍差異顯著[9]。由于葉綠體結(jié)構(gòu)改變及葉綠素含量降低，黃化植株的光合能力總體低于野生型植株。

3 黃化突變遺傳特性及其分子機制

3.1 黃化突變遺傳特性

黃化突變體的葉綠素合成或葉綠體組成受到影響，多由核基因突變造成的。黃化突變中顯性突變較少。TSANG等[34]構(gòu)建的谷氨酸1-半醛氨基轉(zhuǎn)移酶(GSA-AT)甘藍型油菜反義構(gòu)建體(GSA)，T1代轉(zhuǎn)基因株系中葉綠素含量減少，T2代轉(zhuǎn)基因株系的幼苗分離為深綠色、淺綠色和黃色3種不同的表型，這表明GSA反義基因為顯性遺傳。

多數(shù)黃化突變?yōu)殡[性突變，包括單核隱性突變和多核隱性突變2種類型。甘藍型油菜黃化突變體bnaC.ygl的黃化性狀由1對隱性核基因控制，為單核隱性突變[14-15]。芥菜型油菜突變體l638-y的黃化性狀由2對隱性核基因GR1與GR2控制[25,35]；甘藍型油菜葉綠素缺失突變體Bnchd1的黃化性狀由2個隱性基因BnChd1-1和BnChd1-2控制[12]；青梗菜黃化突變體pylm由2對隱性重疊基因(PY1和PY2)互作控制[8]。

3.2 黃化突變分子機制

3.2.1 葉綠素合成受阻 黃化突變直接原因為葉綠素缺失，因葉綠素合成途徑受阻所致。參考吳自明等[36]對被子植物葉綠素合成途徑及反應(yīng)所需酶的總結(jié)，整理出以谷氨酸和α-酮戊二酸為原料，依次合成L-谷氨酰-tRNA、谷氨酸酯-1-半醛、δ-氨基酮戊酸、膽色素原、羥甲基膽后色素原、尿卟琳Ⅲ、糞卟啉原Ⅲ、原卟啉原Ⅸ、原卟啉Ⅸ、鎂原卟啉Ⅸ、鎂原卟啉Ⅸ單甲酯、二乙烯原葉綠素酸酯、原葉綠素酸酯、葉綠素酸酯，最終合成葉綠素a和葉綠素b的途徑。

這些中間產(chǎn)物由20多個基因編碼的15種酶參與合成[37]。甘藍型油菜葉綠素b缺失突變體cr3529的葉綠素合成受阻于膽色素原合成尿卟啉Ⅲ的反應(yīng)步驟[38]。芥菜型油菜黃化突變體l638-y的黃化性狀主要由葉綠素合成途徑中糞卟啉原Ⅲ-原卟啉Ⅸ位點受阻引起[39]。擬南芥鎂原卟啉Ⅸ甲基轉(zhuǎn)移酶(CHLM)敲除突變體，由于鎂原卟啉Ⅸ下游的阻斷，導(dǎo)致葉綠素生物合成中間物質(zhì)的積累[40]。LARKIN[41]使用除草劑Norflurazon阻止葉綠體發(fā)育，利用LHCB報告基因在葉綠體沒有正常發(fā)育的情況下，鑒定了5個LHCB受抑制的突變體(gun1～gun5)，其中g(shù)un2、gun3、gun4、gun5影響質(zhì)體酶合成所需的4種物質(zhì)以及葉綠素前體物質(zhì)鎂原卟啉Ⅸ的水平。KOBAYASHI等[42]通過擬南芥葉綠素缺失突變體研究了類囊體脂基質(zhì)主要物質(zhì)MgdG、GgdG合成的關(guān)鍵酶MGD1和DGD1在擬南芥中的表達譜，發(fā)現(xiàn)MGD1和DGD1的表達受光誘導(dǎo)，其中細胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和長下胚軸5介導(dǎo)的光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)都起著關(guān)鍵作用。HUANG等[43]發(fā)現(xiàn)鎂螯合酶(CHLI)的I亞基由擬南芥中的2個基因CHLI1和CHLI2編碼，CHLI1和CHLI2的雙敲除突變體為白化性狀，而CHLI1單敲除突變體為淡綠色，這表明CHLI2在一定程度上可以替代CHLI1。鎂原卟啉Ⅸ是血紅素和葉綠素的生物合成途徑中的最后1個共同中間體，因此血紅素合成途徑出現(xiàn)突變，也會影響葉綠素的合成。青梗菜pylm黃化突變體的葉片血紅素含量顯著高于對照，說明血紅素具有反饋調(diào)節(jié)作用，血紅素過量積累反饋抑制谷氨酰-tRNA還原酶的活性，抑制δ-氨基酮戊酸的合成[32]。

3.2.2 葉綠體蛋白合成突變 葉綠體的合成是一個復(fù)雜的過程，多數(shù)葉綠體蛋白由核基因編碼，再通過細胞質(zhì)的加工處理，最終在葉綠體內(nèi)發(fā)揮功能[44]。光調(diào)節(jié)鋅指蛋白1(LZF1)在擬南芥脫黃化過程中起正調(diào)節(jié)作用[45]。擬南芥Dynamin超家族新成員FZL，為類似FZO的1種膜重塑蛋白，其過表達后導(dǎo)致類囊體組織缺陷，但其表達水平不影響葉綠體的形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)[27]。沉默氨酰還原酶(ARSs)后，GluRS和SerRS無法正常表達，導(dǎo)致葉綠體異常，類囊體發(fā)育不全，表現(xiàn)出嚴重的黃化性狀，但許多編碼葉綠體或線粒體靶向蛋白的核基因表達以及葉綠素的生物合成沒有改變[28]。

甘藍型油菜cr3529突變體中，類囊體膜蛋白LHCⅡ的組成未發(fā)生改變，但捕光色素蛋白復(fù)合物含量明顯減少[46]。MIURA等[47]對擬南芥葉斑突變體var2進行了研究，認為蛋白質(zhì)合成和降解之間的平衡是導(dǎo)致擬南芥葉色表型的決定因素之一。GUN2和GUN3是已知光致變種hy1和hy2的等位基因，是從血紅素合成植物嗜鉻蛋白所必需的，而GUN5與另一個鎂螯合酶亞基(ChlI)突變體表型的比較表明：ChlH蛋白在質(zhì)體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有特定的功能[48]。擬南芥VAR3基因突變后，體細胞區(qū)域的葉綠體缺失或發(fā)育遲緩，柵欄細胞數(shù)量大量減少[49]，在SAKAMOTO[50]的研究中也有類似報道。SJOGREN等[51]研究證明了擬南芥CLP蛋白酶對葉綠體發(fā)育和功能起到至關(guān)重要的作用。ZALTSMAN等[52]研究發(fā)現(xiàn)：FTSH蛋白酶在葉綠體生物合成和類囊體的維持中起重要作用，且其中部分FTSH基因可能存在冗余，不同的FTSH基因突變體之間的雜交會出現(xiàn)白化、不育等多種新的表型。

4 展望

葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，在光合作用的光吸收中起核心作用。目前模式植物擬南芥中葉綠素合成代謝、葉綠體結(jié)構(gòu)功能已經(jīng)了解得比較清楚。在此基礎(chǔ)上，利用其他十字花科植物黃化突變體，研究十字花科植物黃化形成的分子機制，將為十字花科植物的相關(guān)研究奠定堅實基礎(chǔ)。首先增加葉綠素含量，提高光合效率從而達到增產(chǎn)目的；其次將葉色變異應(yīng)用于高光能育種研究，避免強光下光系統(tǒng)受到傷害，提高植物對強光的耐受性；再次利用葉色突變體植物具有的特殊利用價值，為創(chuàng)造葉色豐富的觀賞品種提供寶貴資源。十字花科植物黃化突變不論在理論研究還是實踐應(yīng)用方面都將是重要的研究方向。