何翼君 張浩然 辛赫男 高磊

作為全球結核病高負擔國家之一，我國結核病患者基數龐大，潛伏感染者眾多。世界衛(wèi)生組織最新頒布的《2020年全球結核病報告》顯示，2019年中國估算結核病新發(fā)患者83.3萬例，估算結核病發(fā)病率為58/10萬[1]。據模型估算，我國約有3.6億人感染結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)[2]，其中絕大多數的感染者將長期處于潛伏感染狀態(tài)，約有5%～10%的人可能在一生中發(fā)展為活動性肺結核[3]，因此結核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)者是一個龐大的潛在“患者庫”。針對肺結核患者的兒童密切接觸者、免疫抑制劑使用者、HIV感染者等高危人群開展MTB感染檢測和預防性治療是結核病防控策略的重要環(huán)節(jié)，但目前仍缺乏感染檢測的金標準。當前，MTB感染的檢測方法主要是基于特異性細胞免疫反應的免疫學檢測方法，其中結核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test，TST)應用歷史悠久，操作簡便，技術成本較低，因此在結核病高負擔國家的MTB感染檢測和結核病輔助診斷工作中發(fā)揮著重要作用。然而，TST結果易受卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)接種、環(huán)境非結核分枝桿菌(non-tuberculosis mycobacteria，NTM)感染、宿主免疫狀態(tài)等多種因素的影響。隨著γ-干擾素釋放試驗(interferon gamma release assay，IGRA)和基于其他反應原的皮膚試驗等新的技術方法的出現，TST的應用價值受到廣泛關注和挑戰(zhàn)。筆者系統(tǒng)梳理了TST用于MTB感染檢測和結核病輔助診斷的技術特點和應用現狀，并提出了進一步優(yōu)化和規(guī)范其應用的建議。

TST的概述

一、TST的技術原理和結果解讀

TST是基于Ⅳ型變態(tài)反應的一種以結核菌素純蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)為抗原誘發(fā)遲發(fā)型超敏反應的皮內檢測方法。MTB感染者體內可產生具有結核抗原識別能力的致敏T淋巴細胞，當機體中存在的致敏T淋巴細胞再次受到相應的MTB抗原刺激，多種可溶性淋巴因子的釋放導致血管通透性增加，巨噬細胞在局部聚集、浸潤，局部出現紅腫硬結，通過測量硬結的平均直徑作為判斷是否感染的標準。Mantoux檢測法是至今使用最廣泛的皮內注射法。醫(yī)務人員采用Mantoux技術在受試者左前臂掌側前1/3中央皮內注射0.1 ml 5個單位(5 IU)PPD，以局部出現7～8 mm大小的圓形橘皮樣皮丘為宜，經48～96 h后測量局部硬結平均直徑的大小。根據2018年開始實施的新版《WS 288—2017 肺結核診斷》(以下簡稱《標準》)，硬結平均直徑<5 mm或無反應者為陰性；硬結平均直徑≥5 mm者為陽性；硬結平均直徑5～10 mm 者為一般陽性；硬結平均直徑10～15 mm者為中度陽性；硬結平均直徑≥15 mm或局部出現雙圈、水泡、壞死及淋巴管炎者為強陽性[4]。對于患有急性傳染病、對多種藥品過敏、無法配合查驗皮膚試驗結果，以及經臨床醫(yī)生判定不適合進行TST的人員，不推薦行TST。另外，考慮到TST易受多種因素的影響，在進行結果解讀時應結合檢測對象皮膚反應的硬結平均直徑大小、暴露史、基礎疾病史、BCG接種史等進行綜合判斷。

二、TST的研發(fā)歷史

1890年，德國細菌學家羅伯特·柯赫(Robert·Koch)首次采用舊結核菌素(old tuberculin，OT)對結核病患者開展治療。OT為MTB在液體培養(yǎng)基中生長和分解的可溶性物質的濃縮液，同時還包括一些與活性無關的多糖及培養(yǎng)基中的各種成分，生產工藝粗糙，成分復雜，易發(fā)生非特異性反應。最終，羅伯特·柯赫對患者實施的治療失敗，但為后續(xù)PPD的誕生奠定了重要基礎[5]。1907年，奧地利兒科醫(yī)生Von Pirquet發(fā)明了結核菌素皮膚刮種法并首次系統(tǒng)地對OT作用后的反應加以解讀，結核菌素劃傷區(qū)域炎性反應與對照區(qū)域明顯不同且炎性反應區(qū)域平均直徑≥5 mm則定義為陽性反應，24～48 h后出現陽性反應表明患者曾感染過MTB，陰性反應則排除了活動性肺結核[6-7]。1934年，Florence B.Seibert采用更加可靠標準的操作流程，利用硫酸銨鹽析法制備出效價和純度更高的PPD[8]。1944年，美國將改進后的PPD產品更名為PPD-S。鑒于PPD-S的純度和效價的提升，1952年世界衛(wèi)生組織正式將其確定為結核菌素的國際標準[9]。目前，PPD試劑采用兩種單位表示，國際單位(international unit，IU)和結核菌素單位(tuberculin unit，TU)。根據生產PPD所用菌株和工藝的不同，國外使用的PPD產品分類主要包括PPD-S、PPD-RT23、PPDIC-65等[10]，我國生產的PPD主要包括TB-PPD和BCG-PPD[11]。

TST的應用

一、MTB感染檢測

目前，MTB感染檢測尚缺乏金標準，TST和IGRA是世界衛(wèi)生組織推薦的兩種免疫學檢測方法。盡管IGRA可實現MTB感染的體外檢測，所使用的抗原與BCG菌株及絕大多數NTM的抗原沒有交叉，具有良好的特異度，但由于IGRA對檢測條件和技術的要求相對更高，需要具備完整的實驗設施以及經過專業(yè)培訓的操作人員及適當的質量控制程序，限制了其在欠發(fā)達地區(qū)的應用和推廣。而TST因操作簡便、檢測成本較低，在全球范圍內尤其是高負擔國家的應用更為廣泛。

2000年，我國第四次全國結核病流行病學抽樣調查首次開展大規(guī)模MTB感染率調查，此次調查通過分層整群等比例抽樣的方法對全國59個調查點的66 456名調查對象采用TST進行了MTB感染篩查。調查結果顯示，TST陽性(TST≥6 mm)人數為29 553人，全人群MTB感染率為44.5%[12]。2013年，筆者團隊針對我國不同結核病疫情地區(qū)共計2萬余名農村常住人口(≥5歲)同時采用TST和IGRA開展了MTB感染的流行病學調查[13]。結果顯示，TST陽性率(TST≥10 mm)為28%(不同地區(qū)為14%～42%)，其中有卡痕者和無卡痕者的TST陽性率分別為32%和24%(P<0.001)；IGRA陽性率為19%(不同地區(qū)為15%～24%)，有無卡痕對IGRA陽性率的影響差異無統(tǒng)計學意義。在調查對象中，TST和IGRA結果的一致性并不理想(Kappa值為0.485)，TST陽性率受BCG接種尤其是加強免疫接種的影響明顯。因此，考慮到我國是BCG普遍接種的國家，基于TST的流行病學調查結果可能會過高估計我國MTB感染的負擔。

二、結核病的輔助診斷

據估計，我國每年報告的活動性肺結核患者中，菌陰肺結核(臨床診斷肺結核)約占全部活動性肺結核患者的40%以上[1]。菌陰肺結核的診斷和療效評估因缺乏病原學金標準的評價指標，需要參考其他實驗室檢測結果。因此，MTB感染檢測結果在輔助診斷菌陰肺結核方面發(fā)揮著重要作用。2018年開始實施的新版《標準》將免疫學檢查列為菌陰肺結核的輔助診斷檢測方法之一。在結核病細菌學、分子生物學、病理學檢查均為陰性的情況下，經鑒別診斷排除其他肺部疾病，胸部影像學檢查符合活動性肺結核表現，同時TST檢查中度陽性或強陽性、IGRA陽性或結核抗體陽性，可定義為臨床診斷肺結核。另外，相較于成人結核病，兒童結核病臨床表現具有多樣性且缺乏特異性，標本采集困難，病原學診斷技術往往不能滿足兒童結核病的診斷需求。在此種情況下，MTB感染檢測作為輔助診斷工具發(fā)揮了更大優(yōu)勢。2016年發(fā)表的一篇Meta分析系統(tǒng)評價了TST和IGRA在免疫功能正常的兒童中輔助診斷活動性肺結核的應用，結果顯示在特異度上TST(86.3%)低于IGRA(95.4%～96.8%)，但TST與IGRA敏感度相似(TST為88.2%，IGRA為88.5%～89.6%)，提示TST在輔助診斷兒童肺結核方面仍然具有重要的應用價值[14]。

三、重點人群的感染監(jiān)測

學校作為人群密集場所，學生群體一直是結核病防控的重點人群。為加強學校結核病防控工作，《學校結核病防控工作規(guī)范(2017版)》(以下簡稱《規(guī)范》)[15]和《中國學校結核病防控指南(2020版)》[16]陸續(xù)出臺。文件關于學校結核病疫情密切接觸者的篩查方法中均指出，15歲以下的密切接觸者應先進行肺結核癥狀調查和TST篩查，對具有肺結核可疑癥狀者或TST強陽性者開展胸部X線攝片檢查，以便早期發(fā)現感染者和肺結核患者。這一舉措的落實對于降低學校結核病傳播風險、保護師生健康將發(fā)揮重要作用。

另外，研究顯示大約5%的新發(fā)感染者可能在感染后1～2年內發(fā)病。因此，新發(fā)感染者也是結核病防控的重點人群[3, 17]。利用TST在密切接觸者、醫(yī)務人員等人群中進行MTB感染的連續(xù)監(jiān)測成為發(fā)現新發(fā)感染者的重要手段。國內外對連續(xù)監(jiān)測過程中TST結果的轉陽有明確的定義：感染陰性時的TST反應<5 mm時，重復檢測結果>10 mm定義為轉陽；如果感染陰性時的結果為5～9 mm，轉陽定義為比之前結果增加10 mm或更高[18-19]。2009—2011年，Adams等[20]對南非地區(qū)7家醫(yī)療機構的醫(yī)護人員進行了一項為期2年的前瞻性隊列研究，共505名醫(yī)護人員分別在基線和12個月以后接受TST和IGRA檢測，后續(xù)隨訪過程中共13名TST基線陰性參與者轉陽(≥10 mm，且相較于基線至少增加10 mm)，根據TST轉陽結果估算結核新發(fā)感染率為38%(95%CI：22%～56%)，醫(yī)護人員在1年內受到感染的風險約是以社區(qū)人群為基礎的對照組的3.5倍。

因此，在學生、非職業(yè)暴露的密切接觸者、職業(yè)暴露的醫(yī)務人員等重點人群中利用TST連續(xù)監(jiān)測感染狀態(tài)的變化，可以早期發(fā)現新發(fā)感染者，界定預防干預的目標人群，這也將成為完善我國“關口前移”防控策略的重要研究方向。

TST結果的影響因素

一、BCG接種及接種策略

BCG是減毒的牛分枝桿菌菌苗，是目前臨床上惟一批準使用的結核病疫苗，因其對兒童結核性腦膜炎和粟粒性肺結核表現出良好的保護效果[21]，已被大多數國家和地區(qū)尤其是結核病高負擔國家列入免疫接種計劃。由于BCG和PPD含有很多共同抗原成分，因此TST的特異性容易受到BCG接種的影響。

2006年，一項系統(tǒng)綜述報道在嬰兒期接種BCG的240 203名研究對象(來自24項研究)中，20 406名(8.5%)研究對象TST≥10 mm歸因于BCG的接種；當BCG接種10年后再次進行TST檢測時，僅有1%(56/5639)的調查對象TST呈陽性。而在1歲后接種BCG的12 728名研究對象(來自12項研究)中，有5314名(41.8%)TST≥10 mm歸因于BCG的接種，BCG接種10年后仍有21.2%(191/898)的調查對象TST呈陽性。研究結果提示，嬰兒期接種BCG對TST試驗結果影響較小，但嬰兒期后再接種BCG會對TST結果產生更持久的影響[22]。

除接種年齡外，BCG接種策略(是否復種)也明顯影響TST結果。1997年之前有近20年時間我國免疫規(guī)劃采取的是BCG加強免疫策略，也就是在初生、7歲和12歲進行3次BCG接種。研究發(fā)現，BCG加強免疫較現行的初生兒一次性接種BCG對TST結果的影響更明顯[23]。因此，在BCG廣泛接種的國家，采用TST進行MTB感染率調查和感染負擔評估時，應充分考慮當地BCG接種策略對評估結果的影響。

二、NTM感染

除BCG外，因存在共同抗原，NTM感染也會對TST結果產生影響。2006年國外一項共納入1 169 105 名調查對象(來自18項研究)的Meta分析提示，不同地區(qū)由于NTM感染導致的TST假陽性率為0.1%～2.3%[22]。2016年，一項針對我國大陸地區(qū)疑似結核病患者NTM感染率的Meta 分析顯示，該人群的NTM感染率約為6.3%，其中我國東南部地區(qū)結核病疑似患者NTM感染率最高(約為8.6%)[24]。該研究提示NTM感染在我國普遍流行，目前國內尚未針對NTM感染對TST結果的影響開展系統(tǒng)評估。

三、宿主自身的免疫狀態(tài)

鑒于TST的檢測原理是基于特異性的T淋巴細胞免疫反應。因此，宿主自身的免疫狀態(tài)會直接影響TST的表現。研究發(fā)現TST在免疫缺陷人群中輔助診斷結核病時，其敏感度明顯降低。2009—2010年，韓國一項前瞻性研究針對119例免疫缺陷病患者開展TST和IGRA檢測，評價兩種方法診斷涂陰肺結核的表現，以培養(yǎng)陽性的肺結核患者或病原學陰性但有疑似活動性肺結核影像學表現并完成抗結核治療的患者作為金標準。研究發(fā)現，TST(≥10 mm)的敏感度為41%，IGRA的敏感度為59%～72%[25]。另外，TST在免疫功能正常的兒童(0～18歲)中診斷病原學陽性結核病的敏感度為88%(95%CI：79%～94%)[14]，但在HIV感染者或患有其他免疫缺陷病的兒童中其敏感度僅為54%(95%CI：49%～59%)[26]。

另外，TST在免疫缺陷人群中檢測MTB感染時，其敏感度也會受到影響。兩項針對免疫缺陷人群MTB感染率調查的系統(tǒng)綜述顯示，在器官移植候選者和血液透析患者中，TST的敏感度分別僅為46%(95%CI：38%～54%)和31%(95%CI：26%～36%)[27-28]。基于此，2018年開始實施的《標準》[4]在對HIV陽性、接受免疫抑制劑治療>1個月、與涂片陽性肺結核患者有密切接觸的5歲以下兒童等免疫缺陷人群開展TST檢測時，以PPD硬結平均直徑≥5 mm作為陽性反應，以提高檢測結果的敏感度。另外，考慮到檢測方法的局限性，2020年世界衛(wèi)生組織最新發(fā)布的《世界衛(wèi)生組織結核病綜合指南：結核病預防性治療》也不再將MTB感染檢測作為在HIV感染者和5歲以下兒童密切接觸者人群中開展預防性治療的先決條件[29]。

四、增強效應

1955年，Magnus和Edwards首次提出TST增強效應的概念[30]，是指在沒有新感染的情況下，已經致敏的機體進行第二次TST時反應較第一次增強。對于遠期感染者或免疫抑制人群來說，增強效應可以減少假陰性的結果，提高感染檢測的敏感度，但是也容易與新發(fā)感染導致的轉陽結果混淆?？紤]到新發(fā)感染導致的TST轉陽存在3～8周的窗口期，如果在1～3周內出現第二次TST反應增加，并且期間幾乎沒有MTB暴露的可能性，那么這種情況很可能歸因于增強效應而非新發(fā)感染[18]。

Salles等[31]為評估肺結核患者的密切接觸者中增強效應發(fā)生率開展了回顧性隊列研究，54%(572/1060)的密切接觸者首次TST結果為陰性(TST≤4 mm)，對其中79%(455/572)的TST陰性密切接觸者開展第二次TST時，有6%(28/455)出現增強效應(TST≥10 mm，且相較于第一次TST結果至少增加6 mm)，而且出現增強效應的28名密切接觸者在隨后2年隨訪過程中均未發(fā)生活動性結核病。由于目前沒有檢測技術可以區(qū)分近期感染和遠期感染，如何有效區(qū)分增強效應和新近感染引起的陽性反應是解讀TST連續(xù)檢測結果時可能面臨的重要問題。針對需要借助增強效應獲得準確TST結果的人群，可以在第一次TST篩查之后的1～3周內在另一只手臂上再次進行TST檢測，并且以第二次TST結果作為判定感染狀態(tài)的依據用于指導臨床決策[18]。

TST在我國的應用及優(yōu)化

相較于IGRA使用單一截斷值作為陽性判斷標準，TST根據不同人群特征選擇不同的截斷值，提高了檢測結果的精細化和準確性?！稑藴省穂4]對不同特征人群應用不同截斷值作為TST陽性的評價標準：針對HIV陽性、接受免疫抑制劑治療>1個月、與涂片陽性肺結核患者有密切接觸的5歲以下兒童等，硬結平均直徑≥5 mm判定為陽性反應；針對于生活居住在BCG接種地區(qū)或NTM感染流行地區(qū)的人群，硬結平均直徑≥10 mm判定為陽性反應；硬結平均直徑≥15 mm或局部出現水泡、壞死、淋巴管炎等判定為強陽性反應。2020年，《中國結核病預防控制工作技術規(guī)范(2020年版)》[32]再次對TST檢測MTB感染的結果判定原則進行了細化：針對無BCG接種史、HIV陽性、接受免疫抑制劑治療>1個月和與病原學陽性肺結核患者有密切接觸的5歲以下兒童等人群，TST硬結平均直徑≥5 mm者視為MTB感染；對有BCG接種史且TST硬結平均直徑≥10 mm者視為MTB感染。由此可見，TST的應用和結果解讀也在逐步適應精準醫(yī)學的要求，進一步細化和優(yōu)化TST在我國不同人群的應用值得探討。

一、優(yōu)化TST的應用策略

考慮到臨床診斷和人群篩查等不同應用場景對產品/技術在特異度和敏感度等方面的表現有不同需求，對TST應用價值的評價也應該考慮其在不同應用場景下的功能定位和目標人群，從而有針對性地提出優(yōu)化建議，避免一概而論。研究發(fā)現，在進行重點人群MTB感染檢測的時候相對于單獨使用TST來說，TST-IGRA兩步法(即首先采用TST進行篩查，對TST陽性的個體再采用IGRA進行確認)可以在有效保證較低檢測成本的同時提高檢測結果的特異度[33]。目前，多個國家已將TST-IGRA兩步法作為MTB感染檢測的可選策略納入國家結核病防控指南[34-36]。使用TST-IGRA兩步法可減少TST假陽性結果造成的不必要的后續(xù)患者發(fā)現成本或預防干預資源投入，是符合成本-效益的MTB感染篩查策略[37-39]。關于TST-IGRA兩步法的適用人群，除其他國家建議的人群，如低結核病負擔地區(qū)的密切接觸者[40]、接種BCG的醫(yī)務人員[41]、啟動腫瘤壞死因子抑制劑治療前的患者[42]等，筆者團隊針對其在學生人群MTB感染篩查工作中的應用價值也進行過探討[33]，發(fā)現在我國BCG普遍接種的前提下，在入校新生中采用兩步法進行MTB感染的篩查對于準確界定高危人群、實施精準干預具有重要的實踐意義，值得進一步探索[43-44]。

另外，基于早期分泌抗原靶蛋白6(early secretory antigenic target 6，ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP-10)皮膚試驗的成功開發(fā)也為TST應用策略的優(yōu)化提供了更多可能性[45-46]。在保持復合抗原具有較高檢測敏感度的基礎上，利用生產用菌株基因改造或生產工藝改進等手段進一步提升PPD的特異性表現也值得探索。

二、細化TST的結果解讀規(guī)范

TST的應用歷史悠久、適用人群龐大，在進一步規(guī)范操作標準的基礎上加強實施性研究，科學評價TST在不同人群的應用表現并在此基礎上細化結果解讀規(guī)范將具有重要意義。新版《標準》結合不同人群的生物學特征，細化TST截斷值的選擇，使得TST的解讀更具科學性，有效控制了既往BCG接種、NTM感染、宿主免疫狀態(tài)等影響因素對TST結果的干擾。不過，針對不同特征的目標人群對檢測結果準確性的不同需求，還需進一步探索TST應用和結果解讀的精細化和標準化，這也是“精準干預”工作的重要需求。其中，利用《定點醫(yī)療機構醫(yī)院信息系統(tǒng)》《結核病信息管理系統(tǒng)》和《基本公共衛(wèi)生服務管理信息系統(tǒng)》，能夠更加系統(tǒng)地收集和分析TST在不同人群的應用信息，將為上述研究提供重要的數據資源[47]。

綜上所述，TST在我國的現代結核病防控工作中仍然具有其自身獨特的應用優(yōu)勢和市場價值。在系統(tǒng)分析的基礎上，進一步優(yōu)化和規(guī)范其在不同目標人群中的應用及結果解讀對于發(fā)揮其技術優(yōu)勢，更好地服務結核病防控工作具有重要的實踐意義。